尤瑞克林對(duì)缺血再灌注大鼠腦神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

李國前，王杰華，楊小霞，潘 瑩，陳淑增，許秀秀

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)是一種具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能的神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生和修復(fù)有著重要的作用［1，2］，探索NGF 的表達(dá)機(jī)制對(duì)于治療神經(jīng)損傷具有重要意義。尤瑞克林是近年研制的國家一類新藥，對(duì)急性腦血管病具有顯著的治療作用［3］，目前作用機(jī)制未完全明確。本實(shí)驗(yàn)探討尤瑞克林對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后大腦皮質(zhì)NGF 表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 成年雄性SD 大鼠24 只，體重250～300 g，福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。注射用尤瑞克林(0.15 PNA 單位/瓶)，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司;Trizol 試劑，美國Invitrogen 公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR 試劑盒，加拿大MBI Fermentas公司;兔抗大鼠NGF 抗體，武漢博士德生物工程有限公司;即用型免疫組化試劑盒(鼠/兔)，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;β-actin 和辣根酶標(biāo)記IgG，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Beyo ECL，Western 熒光檢測(cè)試劑，中國碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 動(dòng)物分組與給藥 實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(sham 組)、模型組(model 組)和實(shí)驗(yàn)組(test 組)，每組8 只。實(shí)驗(yàn)組于再灌注后5 min 靜脈注射用滅菌生理氯化鈉溶液稀釋的尤瑞克林3.5×10-3PNAU/kg，給藥體積1 ml/kg。假手術(shù)組和模型組正常喂養(yǎng)。

1.3 模型制備 模型組和實(shí)驗(yàn)組參考改良Zea-Longa 線栓法［4］制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型。血流阻斷2 h 后拔出線栓，形成再灌注。假手術(shù)組大鼠接受相似手術(shù)處理，但是不插入線栓。再灌注48 h 后處死動(dòng)物斷頭取腦，取右側(cè)大腦半球視交叉后6～11 mm 的缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)區(qū)備用。

1.4 半定量PCR 法檢測(cè)NGF mRNA 的表達(dá)NGF 上游引物為:5’-tccacccacccagtcttcca-3’，下游引物為:5’-gccttcctgctgagcacaca-3’(擴(kuò)增產(chǎn)物344 bp);β-actin 上游引物為:5’-attgtaaccaactgggacg-3’，下游引物為:5’-tctccagggaggaagagg-3’(擴(kuò)增產(chǎn)物490 bp)。取缺血側(cè)腦組織按Trizol 法提取總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為:變性94 ℃30 s，退火64 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為34。反應(yīng)完畢后擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，半定量分析電泳條帶的吸光度，結(jié)果以目的基因與β-actin吸光度的比值表示。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NGF 的表達(dá) 大鼠腦組織切片經(jīng)脫臘至水，室溫孵育5～10 min，高壓修復(fù)2～5 min;加入一抗兔抗大鼠NGF 抗體(工作濃度約為1∶ 100)，4 ℃濕盒孵育過夜;再加入滴加生物素化小鼠抗兔的二抗，室溫30 min，AEC 顯色10～20 min(顯微鏡下控制顯色程度);自來水充分沖洗，終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染;滴加水性封片劑，干燥后中性樹膠封片。各步驟間用0.01 mol/L PBS 沖洗。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù):在400 倍光學(xué)顯微鏡下分別隨機(jī)選取5 個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)免疫反應(yīng)陽性的細(xì)胞數(shù)。

1.6 Western blot 法檢測(cè)NGF 蛋白的表達(dá)取缺血側(cè)腦組織100 mg 置于玻璃勻漿器中，加入裂解液，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行蛋白提取，然后采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取25 μg 蛋白，變性后垂直電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用含10%脫脂奶粉的TBS 室溫封閉2 h，分別加入一抗(兔抗大鼠NGF 抗體，1∶ 1000;兔抗大鼠β-actin 抗體，1∶ 1000)，4 ℃孵育過夜，用含0.1% Tween-20 的TBS 洗滌3 次，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶ 2000)室溫孵育1 h，重復(fù)洗滌3 次，最后用ECL 液顯色，X 片顯影、定影。采用Image J 圖像分析測(cè)定Western blot 條帶灰度值，結(jié)果以NGF 與β-actin 灰度值的比值表示。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠NGF mRNA 的表達(dá)變化 假手術(shù)組NGF mRNA 有微弱的表達(dá)(0.11 ±0.03)。模型組NGF mRNA 表達(dá)較假手術(shù)組顯著增高(0.32 ±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組NGF mRNA 表達(dá)較模型組顯著增高(0.70 ±0.08)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(見表1、圖1)。

2.2 各組大鼠NGF 陽性細(xì)胞的表達(dá)變化 假手術(shù)組僅見少量NGF 陽性細(xì)胞表達(dá)(8.42 ±1.85);模型組NGF 陽性細(xì)胞表達(dá)較假手術(shù)組顯著增多(24.51±5.29)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);實(shí)驗(yàn)組NGF 陽性細(xì)胞表達(dá)較模型組顯著增多(38.46 ±6.10)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(見表1、圖2)。

2.3 各組大鼠NGF 蛋白的表達(dá)變化 假手術(shù)組NGF 蛋白有微弱的表達(dá)(0.13 ±0.02);模型組NGF 蛋白表達(dá)較假手術(shù)組顯著增多(0.34 ±0.06)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);實(shí)驗(yàn)組NGF 蛋白表達(dá)較模型組顯著增多(0.45 ±0.08)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(見表1、圖3)。

表1 各組大鼠NGF 表達(dá)的比較(n=8，)

表1 各組大鼠NGF 表達(dá)的比較(n=8，)

與假手術(shù)組比較* P ＜0.05;與模型組比較#P ＜0.05

圖1 各組大鼠缺血區(qū)腦組織NGF mRNA 的表達(dá)

圖2 各組大鼠缺血區(qū)腦組織NGF 陽性細(xì)胞的表達(dá)(×400)

圖3 各組大鼠缺血區(qū)腦組織NGF 蛋白的表達(dá)

3 討論

NGF 是神經(jīng)系統(tǒng)最主要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，與其高親和性膜受體TrkA 結(jié)合后，經(jīng)胞內(nèi)的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在神經(jīng)元的發(fā)育、軸突的生長(zhǎng)、遞質(zhì)的合成以及細(xì)胞的凋亡等各個(gè)階段均發(fā)揮著重要的作用［5］;同時(shí)參與了調(diào)節(jié)交感、感覺神經(jīng)元的分化和成熟的過程，具有促進(jìn)神經(jīng)元的生存，調(diào)節(jié)突觸效力和可塑性的作用［6，7］。有許多研究表明，腦缺血再灌注損傷后具有自我修復(fù)的潛力，且其修復(fù)與非神經(jīng)元區(qū)的神經(jīng)再生以及NGF 的表達(dá)有著密切的關(guān)系［8，9］。NGF 的分子量很大難以透入血腦屏障，直接給予外源性NGF 治療腦缺血損傷難以湊效;而內(nèi)源性NGF 在腦缺血損傷發(fā)生時(shí)維持時(shí)間短，而且表達(dá)水平有限，難以對(duì)受損神經(jīng)元起到全面、持久的保護(hù)作用。因此給藥途徑和藥物合成是今后研究的重點(diǎn)所在。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷后，模型組大鼠大腦皮質(zhì)NGF 表達(dá)較假手術(shù)組升高，提示機(jī)體可促進(jìn)NGF 的應(yīng)激性表達(dá)上調(diào)，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)，減輕神經(jīng)損害［10］。

尤瑞克林是人尿激肽原酶，是激肽原酶-激肽系統(tǒng)中的重要組成部分。激肽原酶作用于激肽原，使其釋放出激肽，激肽與激肽受體結(jié)合，從而產(chǎn)生一系列的生理作用［11］。基礎(chǔ)研究表明，腦組織缺血損傷后，整個(gè)激肽原酶-激肽系統(tǒng)，包括激肽原酶、激肽均會(huì)一過性地升高，激肽受體表達(dá)也上調(diào)，表明激肽原酶-激肽系統(tǒng)參與腦缺血病理生理過程［12］。藥效學(xué)研究顯示尤瑞克林可明顯提高缺血腦組織的血管儲(chǔ)備功能，增加局部血流灌注量，改善腦微循環(huán);促進(jìn)損傷部位新生血管生成、抑制細(xì)胞凋亡;增加紅細(xì)胞變形能力和氧解離能力;抑制血小板聚集和血液凝固，從而改善腦梗死患者的預(yù)后［13］。在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷难芯恐邪l(fā)現(xiàn):側(cè)腦室轉(zhuǎn)尤瑞克林能夠減小梗死體積、減少細(xì)胞凋亡、減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)、增加細(xì)胞的存活和遷移;缺血后應(yīng)用外源性尤瑞克林可以增加缺血組織血管新生和神經(jīng)再生［11］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后予尤瑞克林進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠大腦皮質(zhì)NGF 表達(dá)較模型組進(jìn)一步升高，證實(shí)尤瑞克林對(duì)改善NGF 的表達(dá)有較好的作用，從而對(duì)神經(jīng)元的功能具有較好的保護(hù)作用。

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