腦脈泰對ApoE 基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩定性的影響

孟 星，牟靜靜，張雨晴，孟盼盼，李 琦

動脈粥樣硬化以脂代謝異常和動脈管壁的炎癥反應為主要特征［1］。在動脈粥樣硬化早期一般發生內皮細胞的破損，中期及后期單核細胞在血管內皮黏附繼而遷移至血管內皮下分化為巨噬細胞，巨噬細胞吞噬脂質形成泡沫細胞，繼而發展為動脈粥樣硬化斑塊。動脈粥樣硬化不穩定斑塊通常具有較大的脂質壞死核心和一個薄纖維帽，炎癥細胞的浸潤和基質金屬蛋白酶的對纖維帽的降解促使不穩定斑塊破裂，而由此引起的心腦血管事件目前已經成為危險人類健康的一大因素。ApoE 基因敲除小鼠在高脂飼料喂養下可自發形成動脈粥樣硬化，且隨時間延長產生動脈粥樣硬化斑塊損傷，這種病理發展情況與人動脈粥樣硬化病情發展一致，常用于動脈粥樣硬化模型的建立。腦脈泰膠囊為桂林三金藥業股份有限公司生產的中藥新藥，由三七、銀杏葉、當歸、紅花、丹參等活性中藥成分組成，具有益氣活血、熄風豁痰、化瘀通絡的功效［2］。本實驗以ApoE基因敲除小鼠作為動脈粥樣硬化研究模型，探討腦脈泰對斑塊穩定性的影響及MMP-9、MMP-2、CD68在不穩定斑塊中的作用。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器 腦脈泰膠囊內容物由桂林三金藥業提供(批號:130904)。阿托伐他汀，輝瑞制藥有限公司生產。西方膳食高脂飼料購于吉林大學實驗動物中心，含脂肪25%、膽固醇0.15%。HE染色液購于碧云天生物公司。MMP-9 抗體、CD68抗體、MMP-2 抗體購于武漢博士德有限公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG 購于Jackson 公司。DAB 顯色試劑盒(P0202)購于碧云天生物公司。顯微鏡為日本OLYMPUS-BX51。

1.2 實驗動物及分組 ApoE 基因敲除小鼠48 只，雄性，6～8 周齡，體重18～22 g，購于北京維通利華動物中心。適應性喂養1 w 后，隨機分為4組，每組12 只，按照臨床推薦的常用量進行換算灌胃給藥，分別為腦脈泰高劑量組(2.24 g/kg·d)、腦脈泰低劑量(0.56 g/kg·d)、阿托伐他汀陽性對照組(0.01 g/kg·d)、模型組給予等體積的生理鹽水，西方膳食高脂飼料喂養，自由飲水。具有相同遺傳背景的C57/BL6J 小鼠12 只作為陰性對照組，購于吉林大學實驗動物中心，給予等劑量的生理鹽水，普通飼料喂養。以上動物均在SPF 級環境下飼養。

1.3 取材 喂養16 w 后，禁食12 h 以上處死小鼠。沿胸部正中處剪開胸骨，迅速暴露胸腔，用鑷子輕輕夾起搏動的心臟，剪掉右心耳，從心尖處進針開始灌注生理鹽水直至肝臟和肺部泛白，流出的液體透明清亮。取出動脈根部到主動脈弓的脈管，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋。從主動脈根部開始每隔50 μm 連續切片4 張，切片厚度5 μm，連續的4 張切片分別作形態學觀察和免疫組化染色。

1.4 主動脈HE 染色 常規石蠟切片脫蠟脫水:二甲苯(I)、二甲苯(II)各15 min，100%乙醇(I)、100%乙醇(II)各10 min，90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5 min。蘇木精染色10 min，自來水沖去多余染色液2 min，1%鹽酸乙醇分化15 s。伊紅染色30 s，70%乙醇沖去多余的染色液。上行梯度脫水脫蠟后，中性樹膠封片，室溫條件下晾干，鏡下觀察。

1.5 主動脈免疫組化染色 常規石蠟切片脫蠟脫水。室溫條件下，30%過氧化氫滅活內源過氧化物酶活性10 min。PBS 洗3 次，5 min/次。微波抗原修復，將組織切片放于10 mmol、pH6.0 的檸檬酸緩沖液中微波加熱至沸騰，微波爐內放置7 min。反復3 次，最后一次取出緩沖液自然冷卻30 min。PBS 洗3 次，5 min/次。5%胎牛血清37 ℃濕盒孵育25 min，加入PBS 稀釋的一抗CD68(1 ∶ 100)、MMP-9(1∶ 100)、MMP-2(1∶ 100)，4 ℃過夜。PBS漂洗，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，37 ℃孵育50 min。PBS 漂洗后DAB 顯色，鏡下觀察顯色程度。蒸餾水充分沖洗以終止顯色，蘇木精10 s 復染。對照組以PBS 代替抗體，其余相同。上行梯度脫水脫蠟后中性樹膠封片，室溫晾干，鏡下觀察。每張切片選取3 個視野，用Image-Pro plus 6.0進行光密度分析。

1.6 統計學方法 數據采用SPSS 17.0 進行統計，結果以均數±標準差()表示。劑量組之間采用t 檢，P ＜0.05 具有統計學意義。

2 結果

2.1 中藥腦脈泰對小鼠主動脈斑塊的影響經過16 w 的高脂飼料喂養后，模型組在40 ×低倍鏡下內膜出現明顯增厚，有大量斑塊形成。100 ×高倍鏡下可觀察到內膜有大量泡沫細胞聚集，中膜平滑肌排列紊亂并向內膜遷移，部分出現膽固醇結晶。給予中藥腦脈泰后，內膜增厚明顯改善，泡沫細胞減少，中膜平滑肌排列整齊，無膽固醇結晶。給予阿托伐他汀后，內膜增厚程度明顯減小，與腦脈泰組無明顯差異(見圖1、圖2)。

圖1 腦脈泰對ApoE 敲除小鼠主動脈根部病理形態的影響(HE 染色40 ×)

圖2 腦脈泰對ApoE 敲除小鼠主動脈根部病理形態的影響(HE 染色100 ×)

2.2 中藥腦脈泰對動脈斑塊CD68 表達的影響免疫組化結果表明，16 w 后模型組小鼠主動脈內陽性表達(黃褐色顆粒物)明顯較高。用Image Pro plus分析出，陰性組的吸光度值比值為(0.003 ±0.0003)，模型組的吸光度比值為(0.112 ±0.013)。與模型組相比，腦脈泰高低劑量組的吸光度比值均有下降，且有顯著性差異(P ＜0.05)，分別為(0.081 ±0.014)、(0.069 ±0.013)。阿托伐他汀組吸光度也有下降(0.073±0.007)，但與腦脈泰組相比無顯著性差異(見圖3)。

圖3 腦脈泰對ApoE 敲除小鼠主動脈根部CD68 表達的影響

2.3 中藥腦脈泰對動脈斑塊MMP-2 表達的影響 免疫組化結果表明，與陰性組相比(0.003 ±0.0009)，模型組的吸光度(0.131 ±0.013)顯著增高，而腦脈泰低高劑量組的吸光度比值與模型組相比均有下降，分別為(0.059 ±0.0049)(0.062 ±0.0033)，且有顯著性差異(P ＜0.05)。阿托伐他汀組吸光度也有下降(0.071±0.007)，但與腦脈泰組相比無顯著性差異(見圖4)。

圖4 腦脈泰對ApoE 敲除小鼠主動脈根部MMP-2 表達的影響

2.4 中藥腦脈泰對動脈斑塊MMP-9 表達的影響 免疫組化結果表明，模型組小鼠主動脈內陽性表達明顯較高。用Image-Pro plus 分析，陰性組的吸光度值比值為(0.00283 ±0.0003)，模型組的吸光度比值為(0.0987 ±0.000457)，而腦脈泰低高劑量組的吸光度比值與模型組相比均有下降，且有顯著性差異(P ＜0.05)，分別為(0.0605 ±0.000298)、(0.0475 ±0.00023)。阿托伐他汀組吸光度也有下降(0.05007 ±0.000535)，但與腦脈泰組相比無顯著性差異(見圖5)。

圖5 腦脈泰對ApoE 敲除小鼠主動脈根部CD68 表達的影響

3 討論

從內皮損傷到斑塊破裂，細胞外基質和炎癥反應在動脈粥樣硬化的發展過程中各個階段占據重要作用。基質金屬蛋白酶是一種可以降解細胞外基質成分(膠原、明膠、彈性蛋白、纖維連接蛋白等)的鋅依賴性蛋白酶。它可在眾多細胞中產生，正常情況下基本不表達而在病理重塑過程中表達增多。在斑塊發展的起始階段，細胞外基質產生代償性重塑。在動脈粥樣硬化晚期，局部基質金屬蛋白酶的過度表達和炎癥細胞的浸潤引起細胞外基質代謝紊亂，纖維帽變薄，引發斑塊的破損［3，4］，最終引發急性心血管事件。

動脈粥樣硬化斑塊形成是一個平滑肌細胞的遷移過程，這個過程與基質金屬蛋白酶密切相關，尤其是MMP-2 和MMP-9，它們可降解平滑肌細胞周圍的膠原破壞斑塊的穩定性［5］。MMP-2 是一種分子量大小為72 kD，可降解膠原的基質金屬蛋白酶。目前研究表明MMP-2 可降解細胞外基質繼而促進平滑肌細胞的遷移和增殖。MMP-2 在人動脈粥樣硬化斑塊破損處高表明MMP-2 參與單核細胞遷移至血管內膜并影響巨噬細胞在血管內膜的增殖［6］。Masafumi 等研究表明，MMP-2 敲除可導致ApoE-/-小鼠動脈斑塊的破損，這種由MMP-2 誘導的斑塊不穩定性可能是由于其促進平滑肌細胞在纖維帽處累積引起的［7］。MMP-9 主要由巨噬細胞和中性粒細胞合成并釋放，一般情況下以非活性酶原存在，端功能前區被蛋白酶剪切后激活。MMP-9 具有較強的細胞外基質降解作用，可降解動脈粥樣斑塊纖維帽的重要組分4 型膠原［8］，在炎癥反應和血管再生中起重要作用。本實驗中通過以高脂飼料喂養小鼠建立動脈粥樣硬化模型，發現與陰性對照組相比，ApoE基因敲除小鼠的主動脈根部MMP-2 和MMP-9 表達均顯著性增多。給予腦脈泰后，主動脈根部MMP-2和MMP-9 表達均顯著下降，并且與陽性對照藥阿托伐他汀組比較無顯著性差異，這表明腦脈泰可能通過降低MMP-9 和MMP-2 的表達發揮對動脈粥樣硬化斑塊的保護作用。

動脈粥樣硬化不穩定斑塊肩部富含巨噬細胞，極易發生破損［5］。CD68 是LAMP 家族的糖基化蛋白，在各組織的巨噬細胞表面均有表達，常用于巨噬細胞的組化標記［9］。CD68 是臨床上炎癥和腫瘤的標志。Ramprasad 等通過配體印跡法和親和純化法證明CD68 可與氧化低密度脂蛋白結合［10］，形成泡沫細胞，促進動脈粥樣硬化不穩定的發展。宋京郁等通過對人冠狀動脈粥樣硬化標本的CD68 分布的檢測發現動脈斑塊的肩部CD68 陽性巨噬細胞表達和纖維帽區壞死核心及其他部位有顯著差異，證明CD68 陽性巨噬細胞與人類動脈粥樣硬化的病變發展和不穩定斑塊的炎癥浸潤繼而破損有關［11］。本研究發現，ApoE 基因敲除小鼠主動脈根部動脈粥樣硬化斑塊處CD68 表達顯著增多。而腦脈泰高低劑量組均可降低CD68 在斑塊處的表達，減少巨噬細胞的浸潤。阿托伐他汀組CD68 的表達與腦脈泰組無顯著性差異，這表明腦脈泰可能通過減少巨噬細胞的浸潤以維持動脈粥樣硬化斑塊的穩定性。

腦脈泰由田七、人參、丹參、銀杏葉等中藥組成。丹參酮具有抗炎和抗氧化作用，可以降低動脈粥樣硬化斑塊MMP-2 的表達以維持動脈粥樣硬化斑塊的穩定性［12］。銀杏提取物銀杏內酯B 可抑制血小板聚集和釋放，降低炎癥反應，減緩動脈粥樣硬化的發展［13］。因此腦脈泰具抗動脈粥樣硬化的藥理學基礎。阿托伐他汀可選擇性抑制HMG-CoA 還原酶，降低膽固醇和脂蛋白水平，臨床上常用于降血脂和抗動脈粥樣硬化。我們的研究結果表明，動脈粥樣硬化情況下，內膜明顯增厚，部分出現膽固醇結晶，斑塊處MMP-2 和MMP-9、CD68 明顯表達，而腦脈泰膠囊和阿托伐他汀不僅可顯著減少動脈斑塊的增厚程度，更降低上述炎癥因子的表達，且腦脈泰高低劑量組和阿托伐他汀組在降低程度上無顯著性差異，這表明腦脈泰可能激活了機體內在保護作用，延緩動脈粥樣硬化的發展，進而減少動脈斑塊的不穩定性以發揮保護作用。

［1］Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease［J］.J New England Medicine，1999，340(2):115 -126.

［2］鄒節明，潘佐靜，王淑霖.腦脈泰膠囊藥效學及毒理研究［J］.中國醫藥學報，2003，18(7):408 -413.

［3］Nikkari ST，O ’Brien KD，Ferguson M，et al.Interstitial collagenase(MMP-1)expression in human carotid atherosclerosis［J］.Circulation，1995，92(6):1393 -1398.

［4］Shah PK，Falk E，Badimon JJ，et al.Human monocyte-derived macrophages induce collagen breakdown in fibrous caps of atherosclerotic plaques.Potential role of matrix-degrading metalloproteinases and implications for plaque rupture［J］.Circulation，1995，92(6):1565-1569.

［5］Galis ZS，Sukhova GK，Lark MW，et al.Increased expression of matrix metalloproteinases and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atherosclerotic plaques［J］.J Clinical Investigation，1994，94(6):2493.

［6］Pasterkamp G，Schoneveld AH，Hijnen DJ，et al.Atherosclerotic arterial remodeling and the localization of macrophages and matrix metalloproteases 1，2 and 9 in the human coronary artery［J］.Atherosclerosis，2000，150(2):245 -253.

［7］Kuzuya M，Nakamura K，Sasaki T，et al.Effect of MMP-2 deficiency on atherosclerotic lesion formation in apoE-deficient mice［J］.Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology，2006，26(5):1120-1125.

［8］Williams AR，Hatzistergos KE，Addicott B，et al.Enhanced effect of human cardiac stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells to reduce infarct size and restore cardiac function after myocardial infarction［J］.Circulation，2012，112:131110.

［9］Graeber MB，Streit WJ，Kiefer R，et al.New expression of myelomonocytic antigens by microglia and perivascular cells following lethal motor neuron injury［J］.J Neuroimmunology，1990，27(2):121 -132.

［10］Ramprasad MP，Fischer W，Witztum JL，et al.The 94-to 97-kDa mouse macrophage membrane protein that recognizes oxidized low density lipoprotein and phosphatidylserine-rich liposomes is identical to macrosialin，the mouse homologue of human CD68［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1995，92(21):9580-9584.

［11］宋京郁，孫東植，李太升，等.CD68-陽性巨噬細胞在人冠狀動脈粥樣硬化病變中的分布特點及其意義［J］.中國動脈硬化雜志，2009，17(8):657 -660.

［12］Fang Z，Lin R，Yuan B，et al.Tanshinone IIA downregulates the CD40 expression and decreases MMP-2 activity on atherosclerosis induced by high fatty diet in rabbit［J］.J Ethnopharmacology，2008，115(2):217 -222.

［13］劉熹昀，趙革新，鮑 利，等.銀杏內酯B 對ApoE 基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響［J］.中國藥理學通報，2011，27(1):81-84.