胱氨酸干預下AD 模型鼠海馬CA1區神經干細胞凋亡影響因子NPM 表達變化情況

李叢言，盛寶英，韓 鳳，齊志國，張瑞雪

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是神經退行性病變，其主要表現以癡呆為主，經研究表明其為變異性疾病所致的退行性改變，與年齡有一定相關性。生活能力減低、記憶和認知功能成時間性減退，并有不斷加重的趨勢，同時伴有行為的改變和精神神經改變。據不完全統計，在全球阿爾茨海默病發病率呈上升趨勢［1～3］。其發病機制的研究在醫學科研中逐漸被重視并予以極大的關注，但其具體的發病機制還不是十分清楚，治療也缺乏有效的方法，對人類健康造成極大的危害。本實驗研究的目的是觀察胱氨酸在AD 模型鼠中的治療作用及其可能的機制。為AD 的治療提供有益的臨床思路。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗動物和藥品 大連醫科大學動物實驗中心提供清潔級Wistar 大鼠66 只。凋亡檢測試劑盒，購于同仁化學研究所。NPM 抗體，購于武漢博士徳生物工程有限公司。Aβ1-40購自上海瑞奇生物科技有限公司。胱氨酸購于Labsigma co.ltd，其他試劑為實驗室常用試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及模型制備 將Wistar 大鼠66 只，隨機分為3 組，一組為正常組(n=6);一組為AD 模型組(n=30)和胱氨酸治療組(n=30)。將60只大鼠固定于腦立體定位儀上，前囟后3.8 mm，中線左2 mm，腦表面進針3 mm，緩慢注射2 min，2 μl 凝聚態Aβ1-40(10 μg·μl-1)，留針10 min，緩慢拔出，縫合切口，術后大鼠在低溫下蘇醒。再對60 只大鼠進行行為學驗證，并將篩選出的AD 模型組，胱氨酸治療組行腹腔注射胱氨酸，60 只大鼠行NPM 的相關染色和檢測。Morris 水迷宮檢測AD 模型大鼠。Morris水迷宮:圓形水池直徑120 cm，深50 cm，水溫21 ℃±1.5 ℃。任選一象限在其中央放置平臺，平臺無色透明，直徑6 cm，高30 cm，液面高于平臺2 cm，水池周圍參照物固定。訓練包括:定位航行實驗:歷時45 d，每半日為一段，每個段試驗4 次，將Wistar 大鼠分別從4 個象限入水，記錄其找到平臺時間(逃逸潛伏期，Latency escape)與游泳路徑?？臻g探索實驗:第5 天下午撤除平臺，觀察120 s 內雙轉基因小鼠第一次穿越平臺坐標的時間、穿越平臺次數、游泳路徑等。

1.2.2 給藥方法 為了使給藥后胱氨酸在AD模型大鼠達到較為理想的藥物濃度，本實驗根據有關說明及該藥藥品說明書中藥代動力學的相關內容，將胱氨酸溶于滅菌注射用水(50 mg/ml)，采用腹腔注射的方法對胱氨酸組AD 模型大鼠給予注射胱氨酸(150 mg/kg/day)，1 d、3 d、7 d、14 d、21 d 這幾個時間點給予胱氨酸組AD 模型大鼠腹腔注射等劑量的胱氨酸。

1.2.3 免疫印跡法 (Western-blot)檢測AD模型大鼠海馬區NPM 因子的表達。免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質印跡(Western blotting)，是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。結合化學發光檢測，可以同時比較多個樣品同種蛋白的表達量差異。

1.2.4 r-tPCR 檢測AD 模型大鼠海馬區NPM基因的表達 參照文獻［4］設計跨NPM 基因第12 外顯子的PCR 引物，上游引物:5’-TTA ACTCTCTGGTGGTAGAATGAA-3’;下 游 引 物:5’-CAAGACTATTTGCCATT CCTAAC-3’，產物大小為560 bp。PCR 擴增體系為20 μl，PrimeSTAR DNA Ploymerization 0.5 U。反應條件:95 ℃預變性5 min 后，98 ℃30 s，55 ℃1 min，72 ℃1 min，共35 個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR 擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將產物純化后進行測序鑒定。在判定結果時，用循環閾值(cycle threshold，CT)作為臨界點，該點位于PCR 產物進入指數增長期的起始點。50 μl PCR 反應體積中，含5XPCR 反應液［50 mmol/ L Tris-HCl(pH8.3)、10 mmol/L MgCl2、250 mmol/L KCl、1 mg/ml 明膠］10 μl，mdr-1 上下游引物各15 pmol/L，熒光探針10 pmol/L，Taq 酶3 U和不同樣本自100 ng RNA 逆轉得到的cDNA，同時將定量模板梯度稀釋，作標準曲線，在 ABI PRISM7700 型實時檢測擴增儀上進行擴增，反應條件為93 ℃預變性3 min，93 ℃40 s，55 ℃120 s 共作40 個循環。反應結束后用計算機將樣本與標準曲線對比得出NPM 基因表達的拷貝數。

1.2.5 TUNEL 凋亡細胞檢測 根據TUNEL試劑盒操作方法行石蠟包埋各組大鼠海馬CA1區組織切片染色，選取高倍視野(400 ×)下6 個視野平均陽性細胞數，以均數±標準差行組間對比。

2 結果

2.1 水迷宮的行為學變化 在定位航行試驗中，AD 模型大鼠的平均逃逸潛伏期顯著長于正常組大鼠(P ＜0.01)。在空間探索實驗中，AD 模型大鼠在120 s 內穿越原平臺位置的次數顯著少于正常組小鼠(P ＜0.01)。在定位航行試驗中，胱氨酸干預下AD 模型大鼠的平均逃逸潛伏期顯著短于AD模型大鼠(P ＜0.01)。在空間探索實驗中，胱氨酸干預下AD 模型大鼠在120 s 內穿越原平臺位置的次數較AD 模型大鼠明顯增多(P ＜0.05)(見表1)。

2.2 海馬CA1區NPM 因子表達的變化 注射胱氨酸3 d 后，胱氨酸治療組大鼠較AD 模型大鼠NPM 因子的表達明顯增加(P ＜0.01)，具有統計學意義，于14 d 達到高峰，此后雖呈現下降趨勢，但仍維持在較高水平(見表2)。

2.3 海馬CA1區細胞凋亡的變化 實驗進行7 d后，AD 模型組大鼠海馬CA1區細胞凋亡數明顯高于正常對照組(P ＜0.01)，具有統計學意義，并于14 d后達到高峰，并持續到21 d。經胱氨酸干預后7 d時細胞凋亡數減少(P ＜0.05)，于14 d 后達到最低(P ＜0.01)，21 d 時細胞凋亡數較干預14 d 時有所增加(P ＞0.05)(見表3)。

表1 Morris 水迷宮各實驗組平均穿越次數(次，n=6，)

表1 Morris 水迷宮各實驗組平均穿越次數(次，n=6，)

與正常對照組比* P ＜0.01;與AD 組比#P ＜0.01

表2 實驗不同時間點海馬CA1區NPM 因子表達的變化(OD 值，n=6，)

表2 實驗不同時間點海馬CA1區NPM 因子表達的變化(OD 值，n=6，)

與正常對照組比△P ＜0.05;與正常對照組比* P ＜0.01;與AD 組比#P ＜0.01

表3 不同時間點各組海馬CA1區細胞凋亡計數(個，n=6，)

表3 不同時間點各組海馬CA1區細胞凋亡計數(個，n=6，)

與正常對照組比△P ＜0.05;與正常對照組比* P ＜0.01;與AD 組比▽P ＜0.05;與AD 組比#P ＜0.01

3 討論

Alzheimer 病(AD)是神經元喪失的神經退行性變。由于缺乏有效的治療方法，在發達國家AD 已成為繼心臟病、癌癥和卒中之后人類第四位的死因。該病的臨床特點是近期記憶和智力功能進行性惡化。神經病理學特點是在大腦皮質和海馬出現大量的老年斑(senile plaque，SP)和神經元纖維纏結(neurofibrilary tangle，NFT)，并伴隨出現神經元喪失。近年來許多資料表明，細胞凋亡(apoptosis)即程序性細胞死亡(programmed cell death，PCD)過多，引起神經元喪失是腦組織退行性疾病發生的原因之一，內外因素激活細胞自身基因程序而引起神經元凋亡。有實驗研究表明，Aβ1-40能夠誘導腦內皮質神經元的程序性細胞死亡，并出現級聯反應，從而誘導更多的神經元發生凋亡，導致神經功能喪失［5，6］。在本實驗中發現Aβ1-40使大鼠海馬CA1區神經干細胞凋亡增加，減少了同源性神經細胞的生理性補充作用。神經干細胞的丟失也可能參與了神經缺損的修復功能的減低。在神經細胞受損后的保護機制中，神經細胞能夠通過產生核磷蛋白(NPM)，后者通過間接途徑發揮抗凋亡作用，抵抗腦缺血損傷，使細胞得以存活。要挽救走向凋亡的神經元，保護腦功能，進行藥物干預加強NPM 的表達也許會是一種可行的方法。Aβ1-40損傷減少了NPM 的表達，從而削弱了其保護作用，誘發了凋亡的發生。

核磷蛋白是一種多功能的蛋白質，參與核糖體的生物合成，控制中心體復制，具有分子伴侶作用，并可通過多種信號通路調節細胞增殖和凋亡。研究發現，NPM 在增殖活躍的細胞中呈過度表達，產生過量核磷蛋白，從而起到抵抗凋亡的作用，雖然沒有證據表明NPM 直接參與凋亡機制，但它可通過間接途徑參與凋亡調控［7］。目前，有關NPM 在全腦缺血缺氧誘導的神經細胞凋亡方面的作用及機制尚未完全明了，國內外相關的研究還較少。

胱氨酸是一種小分子含二硫鍵的胺鹽，具有抗氧化應激及抑制神經細胞退行性變的作用。近年來國外通過動物、離體細胞實驗對帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病及阿爾茨海默病等神經退行性病變研究表明胱氨酸可以抑制神經細胞的凋亡，這為研究AD 患者神經干細胞抗凋亡治療提供新的思路。但是，其抗神經元凋亡機制及具體通路尚未明了，特別是與AD 腦細胞損傷的關系以及調控其表達的各種因素之間的關系目前尚無研究。本實驗中可以觀察到胱氨酸干預后Aβ1-40對神經干細胞的損傷作用減弱，凋亡發生率減低，同時NPM 表達有所上調，其作用途徑是否由于NPM 上調從而起到細胞保護作用還有待進一步研究。

［1］Simon L，Michael P，James C，et al.Genetics，molecular biology，neuropathology and phenotype of frontal lobe dementia:A case history［J］.British Journal of Psychiatry，2002，180:455 -460.

［2］Nilsen LH，Mel TM，Saether O，et al.Altered neurochemical profile in the McGill-R-Thy1-APP rat model of Alzheimer’s disease:a longitudinal in vivo 1H MRS study［J］.J Neurochemistry，2012，123(4):532 -541.

［3］Rodrigues Elizabeth M，Weissmiller April M，Goldstein Lawrence SB，et al.Enhanced［beta］-secretase processing alters APP axonal transport and leads to axonal defects［J］.Human Molecular Genetics，2012，21(21):4587 -4601.

［4］Dohner K，Schlenk RF，Hab dank M，et al.Mutant nucleophosmin(NPM1)predicts favorable prognosis in younger adults with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics interaction with other gene mutations［J］.Blood，2005，106(12):3740 -3746.

［5］Thathiah A，De Strooper B.The role of G protein-coupled receptors in the pathology of Alzheimer’s disease［J］.Nature Reviews Neuroscience，2011，12(2):73 -87.

［6］Bromley B，Kelley S，Song Wei-hong，et al.The role of TMP21 in trafficking and amyloid-［beta］precursor protein (APP)processing in Alzheimer’s disease［J］.Current Alzheimer Res，2012，9(4):411 -424.

［7］徐誠望，楊曉明.核磷蛋白與腫瘤的發生［J］.軍事醫學科學院院刊，2008，32(4):382 -385.