Foxp3 和HO-1 在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓中的相關(guān)性表達(dá)及依達(dá)拉奉保護(hù)作用的研究

李世平，劉 露，張美月，王 彬，劉瑞春，郭 力，董 梅

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘性疾病，兼有軸索損傷，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，新近研究表明，MS 患者CD4+CD25+Foxp3+Tregs 數(shù)目和/或功能異常，暗示其在MS 的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用［1，2］。CD4+CD25+Foxp3+Tregs 以Foxp3 為特異性的標(biāo)志，是其發(fā)育和功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在維持外周免疫耐受、預(yù)防自身免疫性疾病的發(fā)生方面起著重要作用［3］。HO-1 是亞鐵血紅素代謝途中的限速酶，它及其催化產(chǎn)物具有抗氧化、清除自由基的功能，同時(shí)其在CD4+CD25+Foxp3+Tregs 上的表達(dá)上調(diào)也能促進(jìn)后者的發(fā)育和功能，抑制效應(yīng)型T 細(xì)胞的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)免疫平衡［4］。

依達(dá)拉奉(Edaravone)是一種新型的氧自由基清除劑，能保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞免受氧化損傷。最近有證據(jù)表明依達(dá)拉奉能顯著減輕EAE的臨床癥狀，減少脊髓中淋巴細(xì)胞的浸潤［5］，對MS可能具有治療價(jià)值，但治療機(jī)制尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。我們通過免疫Wistar 大鼠建立EAE 動(dòng)物模型，觀察依達(dá)拉奉對EAE 大鼠是否有治療作用，并探討其對疾病治療可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑器材

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性Wistar 大鼠180只，6～8 周齡，體重180～220 g;清潔級豚鼠8 只，雌雄不限，體重在350～450 g 之間，均購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號SCXK 冀2008-1-003)。

1.1.2 試劑及儀器 佐劑用卡介苗60 mg/支(北京生物制品研究所)，依達(dá)拉奉注射液5 ml/10 mg(南京先聲東元制藥有限公司)，反義核酸第一鏈cDNA 合成試劑盒、SYBR qPCR 綠色體系(加拿大Fermentas 公司)。石蠟切片機(jī)(德國LEICA 公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Nikon 公司)，ABI PRISM 7300 熒光PCR 儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w，隨機(jī)分為3 組EAE 組、依達(dá)拉奉組和對照組。根據(jù)EAE 動(dòng)物發(fā)病規(guī)律，將每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物又分為3 個(gè)發(fā)病時(shí)期進(jìn)行研究。大鼠最早發(fā)病為免疫后12 d;發(fā)病高峰為病后3～5 d，我們將免疫后第10 天取材記為發(fā)病前組，發(fā)病后第3 天取材記為高峰期組，發(fā)病后第7 天取材記為緩解期組。

1.2.2 EAE 模型的制備 取新鮮豚鼠全脊髓組織與生理鹽水按1∶ 10 的比例混合勻漿，再加入含有6 mg/ml 卡介苗的完全福氏佐劑(CFA)充分混合成油包水狀乳劑，按0.5 ml/大鼠于四足墊及背部以0.1 ml/部位皮下注射免疫動(dòng)物，誘導(dǎo)EAE 模型的建立。

1.2.3 藥物干預(yù) 免疫當(dāng)天記為第0 天，當(dāng)天即給予依達(dá)拉奉組大鼠每只10 mg/kg(約為1 ml/大鼠)依達(dá)拉奉注射液腹腔內(nèi)注射干預(yù)治療，同時(shí)給予EAE 組和對照組大鼠等劑量生理鹽水腹腔內(nèi)注射作為對照，以后每天一次，持續(xù)至處死。

1.2.4 行為學(xué)觀察 自免疫后第一天開始，每天分上、下午兩次觀察大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)情況，記錄大鼠的發(fā)病起始日期，并參照通用的評分標(biāo)準(zhǔn)對發(fā)病的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分:0 分:不發(fā)病;1 分:動(dòng)物尾部無力;2 分:后肢輕度癱瘓+步態(tài)不穩(wěn);3分:中度癱瘓但自主運(yùn)動(dòng)保存;4 分:肢體嚴(yán)重癱瘓，自主運(yùn)動(dòng)不能;5 分:瀕死狀態(tài)。癥狀介于兩標(biāo)準(zhǔn)之間者以±0.5 分計(jì)。

1.2.5 病理學(xué)觀察及免疫組化檢測脊髓中Foxp3 和HO-1 的表達(dá) 將大鼠用4%多聚甲醛灌注固定，取脊髓腰膨大常規(guī)石蠟切片，HE 染色，觀察組織病理學(xué)改變，免疫組化測定Foxp3 和HO-1 陽性細(xì)胞表達(dá)。

1.2.6 Real-time PCR 檢測脊髓中Foxp3 mRNA 和HO-1 mRNA 的含量 (1)總RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):取大鼠脊髓腰膨大組織，采用Trizol 法抽提總RNA，將樣本稀釋后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系:5×Buffer 4 μl，RNA 酶抑制劑1 μl，10 mM dNTP Mix 2 μl，M-MULV 反轉(zhuǎn)錄酶1 μl，隨機(jī)六聚體引物1 μl，總RNA 和去離子水，反應(yīng)總體系20 μl。反應(yīng)程序:加熱25 ℃5 min→42 ℃60 min→70 ℃5 min→終止反應(yīng)。(2)Real-time PCR 擴(kuò)增，按說明書稀釋引物(上海生工生物工程有限公司合成)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系:qPCR Master Mix 12.5 μl，上、下游引物各1 μl，模板cDNA2 μl，去離子水8.5 μl 至終濃度25 μl。擴(kuò)增程序:UDG-預(yù)處理50 ℃2 min 1 個(gè)循環(huán)→起始變性95 ℃10 min 1 個(gè)循環(huán)→變性95 ℃15 s、退火60 ℃30 s、延伸72 ℃30 s 40 個(gè)循環(huán)→反應(yīng)終止。儀器自動(dòng)匯總熒光值后進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，發(fā)病率以百分?jǐn)?shù)表示，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，相關(guān)性采用Liner Correlation，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物發(fā)病情況 EAE 組大鼠自免疫后第10 天開始出現(xiàn)食欲不振、活動(dòng)減少等現(xiàn)象，免疫后第12 天開始陸續(xù)發(fā)病，發(fā)病率為80.4%，依達(dá)拉奉組大鼠發(fā)病前不適癥狀較少，起病時(shí)間及發(fā)病率均晚于EAE 組(P ＜0.05)，且發(fā)病第3 天神經(jīng)功能評分依達(dá)拉奉組也低于EAE 組(P ＜0.05)(見表1)。

2.2 病理學(xué)表現(xiàn) EAE 組大鼠發(fā)病前期脊髓組織有散在炎性細(xì)胞浸潤，高峰期可見炎性細(xì)胞彌漫性浸潤，多數(shù)小血管周圍出現(xiàn)典型“袖套樣”改變，緩解期炎性細(xì)胞和“血管袖套”減少。依達(dá)拉奉組各時(shí)期炎性細(xì)胞浸潤程度均小于EAE 組(見圖1)。

2.3 脊髓組織中Foxp3 和HO-1 陽性細(xì)胞表達(dá)EAE 組脊髓中不同時(shí)期Foxp3 和HO-1 陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均較同期對照組明顯增高(P ＜0.05)，且隨著疾病發(fā)展，發(fā)病高峰期與發(fā)病前期相比及緩解期與高峰期相比數(shù)量均顯著增高(P ＜0.05)。Edaravone干預(yù)后，與EAE 組各時(shí)期對比，各指標(biāo)數(shù)量均明顯增加(P ＜0.05)，其中高峰期增加最明顯，高于發(fā)病前期及恢復(fù)期(P ＜0.05，見表2、表3)。

2.4 脊髓中Foxp3 mRNA 和HO-1 mRNA 表達(dá)EAE 組炎癥因子Foxp3 mRNA 表達(dá)在發(fā)病前期即開始增高，急性期明顯增高，疾病好轉(zhuǎn)后仍繼續(xù)增高(P ＜0.05)。Edaravone 組Foxp3 mRNA 表達(dá)在發(fā)病高峰期迅速明顯增高，恢復(fù)期略有下降，但均高于同期EAE 組(P ＜0.05)。EAE 組HO-1 mRNA 含量同樣隨疾病進(jìn)展而增高(P ＜0.05)，Edaravone 組同樣在疾病高峰期HO-1 mRNA 含量最高，恢復(fù)期稍降低，但均高于EAE 組(P ＜0.05，見表4、表5)。

2.5 Foxp3 和HO-1 相關(guān)性檢驗(yàn) EAE 組及Edaravone 組脊髓中HO-1 mRNA 與Foxp3 mRNA 含量呈顯著的正相關(guān)性(P ＜0.05，r ＞0)。

表1 大鼠發(fā)病情況比較

表2 3 組中不同時(shí)期脊髓中Foxp3 陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目的比較()

表2 3 組中不同時(shí)期脊髓中Foxp3 陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目的比較()

EAE 組與對照組比較* P ＜0.05;依達(dá)拉奉組與EAE 組比較#P ＜0.05;發(fā)病7 d 組與發(fā)病3 d 組比較△P ＜0.05;發(fā)病3 d 組與發(fā)病前組比較▽P ＜0.05

表3 3 組中不同時(shí)期脊髓中HO-1 陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目的比較()

表3 3 組中不同時(shí)期脊髓中HO-1 陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目的比較()

EAE 組與對照組比較* P ＜0.05;依達(dá)拉奉組與EAE 組比較#P ＜0.05;發(fā)病7 d 組與發(fā)病3 d 組比較△P ＜0.05;發(fā)病3 d 組與發(fā)病前組比較▽P ＜0.05

表4 3 組中不同時(shí)期脊髓中Foxp 表達(dá)的比較()

表4 3 組中不同時(shí)期脊髓中Foxp 表達(dá)的比較()

EAE 組與對照組比較* P ＜0.05;依達(dá)拉奉組與EAE 組比較#P ＜0.05;發(fā)病7 d 組與發(fā)病3 d 組比較△P ＜0.05;發(fā)病3 d 組與發(fā)病前組比較▽P ＜0.05

表5 3 組中不同時(shí)期脊髓中HO-1 表達(dá)的比較()

EAE 組與對照組比較* P ＜0.05;依達(dá)拉奉組與EAE 組比較#P ＜0.05;發(fā)病7 天組與發(fā)病3 天組比較△P ＜0.05;發(fā)病3 天組與發(fā)病前組比較▽P ＜0.05

3 討論

MS 是CNS 炎性脫髓鞘性疾病，青年女性多見，致殘率高，發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前多推崇免疫和氧化應(yīng)激兩種學(xué)說。CD4+CD25+Foxp3+Tregs，是一個(gè)特殊的CD4+T 細(xì)胞亞群，在維持自身免疫耐受、限制免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 是其特異性的標(biāo)志，在其表面有唯一表達(dá)，也是其發(fā)育和功能的主要調(diào)節(jié)者［6］。正常情況下，初始T 細(xì)胞在外周TGF-β 或某些因素作用下可轉(zhuǎn)變?yōu)門reg，但在炎癥存在時(shí)，大量產(chǎn)生的IL-6 可與TGF-β 共同抑制這種轉(zhuǎn)變，并促使初始T 細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橹鲗?dǎo)免疫反應(yīng)的Th17 細(xì)胞。

研究證明CD4+CD25+Foxp3+Tregs 能組成性的表達(dá)HO-1，HO-1 也能通過抑制Th17 亞群的發(fā)育或上調(diào)CD4+CD25+Foxp3+Tregs 協(xié)調(diào)CD4+CD25+Foxp3+Tregs 與Th17 亞群之間的免疫平衡，在多種疾病在發(fā)揮保護(hù)作用［7，8］。也有研究表明，具有抗氧化作用的促紅細(xì)胞生成素可以通過增強(qiáng)HO-1 的表達(dá)，減輕EAE 發(fā)病的免疫反應(yīng)和炎癥程度［9］，故HO-1 是脫髓鞘疾病氧化應(yīng)激過程中重要的保護(hù)性分子，本研究中可見發(fā)病前期，EAE 組大鼠出現(xiàn)食欲減退和活動(dòng)減少，脊髓組織可見少量炎性細(xì)胞浸潤，F(xiàn)oxp3 和HO-1在組化中的表達(dá)及mRNA 含量均增加，提示EAE 出現(xiàn)臨床癥狀前已發(fā)生細(xì)胞和因子水平的改變。

EAE 組大鼠在發(fā)病后第3 天臨床表現(xiàn)最重，神經(jīng)功能評分最高，脊髓病理染色可以觀察到在灰白質(zhì)交界區(qū)有彌漫性的炎性細(xì)胞浸潤和大量的“血管袖套”形成，脊髓中Foxp3 的mRNA 含量均較對照組顯著增多，提示持續(xù)的炎癥刺激導(dǎo)致靶器官中的CD4+CD25+Foxp3+Tregs 繼續(xù)擴(kuò)增，以限制炎癥反應(yīng)。EAE組大鼠脊髓中HO-1 的mRNA 含量均較發(fā)病前顯著增加，且均較同時(shí)期對照組顯著增多，提示在這一時(shí)期表達(dá)HO-1 的細(xì)胞進(jìn)一步增多，HO-1 更新進(jìn)一步加快以對抗氧化應(yīng)激并調(diào)節(jié)免疫平衡。HO-1 即表達(dá)在CD4+CD25+Foxp3+Tregs 上的，又表達(dá)在神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。在劇烈的炎癥環(huán)境下，一方面表達(dá)在神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞上的HO-1 通過催化降解促氧化劑血紅素生成具有清除自由基功能的膽綠素和膽紅素，以及具有抗凋亡和抗炎特性的一氧化碳(CO)，發(fā)揮抗氧化作用;另一方面，CD4+CD25+Foxp3+Tregs 上HO-1 的表達(dá)可促進(jìn)其發(fā)育和Foxp3的表達(dá)上調(diào)［10］。由此產(chǎn)生了一個(gè)正反饋的途徑促使CD4+CD25+Foxp3+Tregs 發(fā)揮細(xì)胞因子效應(yīng)。發(fā)病后第7 天EAE 大鼠的臨床癥狀開始緩解，神經(jīng)功能評分顯著降低，脊髓Foxp3 的mRNA 含量較高峰期進(jìn)一步增加，提示CD4+CD25+Foxp3+Tregs 在靶器官中持續(xù)增加促進(jìn)了炎癥的消散和疾病的緩解EAE 組大鼠脊髓中HO-1 的mRNA 含量較發(fā)病后第3 天顯著增加，且顯著高于對照組，提示其可能與CD4+CD25+Foxp3+Tregs 協(xié)同促進(jìn)EAE 病程的緩解。

依達(dá)拉奉是一種小分子自由基清除劑，有報(bào)道稱其能改善EAE 的臨床癥狀，但具體機(jī)制尚不十分明確。本研究中觀察到使用依達(dá)拉奉干預(yù)的大鼠起病時(shí)間明顯延遲，發(fā)病率明顯降低，發(fā)病前食欲不振、皮毛不光滑等不適癥狀少見，發(fā)病后第3 天和第7 天神經(jīng)功能評分均顯著低于EAE 組，各時(shí)期脊髓組織切片HE 染色炎性細(xì)胞和“血管袖套”均較EAE組顯著減少，說明依達(dá)拉奉對EAE 有明顯的治療效果。依達(dá)拉奉干預(yù)治療后各時(shí)期脊髓中Foxp3 和HO-1 的mRNA 含量較同時(shí)期EAE 組顯著增加，提示依達(dá)拉奉能促進(jìn)CD4+CD25+Foxp3+Tregs 和HO-1 的更新，而這種作用似乎在疾病的早期更為明顯。因此依達(dá)拉奉對EAE/MS 的治療作用可能是通過促進(jìn)HO-1 的抗氧化并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用以及促進(jìn)CD4+CD25+Foxp3+Tregs 的發(fā)育和功能實(shí)現(xiàn)的。

圖1 各組小鼠發(fā)病不同時(shí)期脊髓HE 染色(IHC，×400)

綜上所述，依達(dá)拉奉作用途徑廣泛，副作用較少，對EAE 具有治療作用，尤其在疾病早期作用更明顯，同時(shí)價(jià)格相對低廉，對MS 具有極大的治療價(jià)值。

［1］Jadidi-Niaragh F，Mirshafiey A.Regulatory T-cell as orchestra leader in immunosuppression process of multiple sclerosis ［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，2011，33(3):545 -567.

［2］Dalla Libera D，Di Mitri D，Bergami A，et al.T regulatory cells are markers of disease activity in multiple sclerosis patients［J］.PLoS One，2011，6(6):e21386.

［3］Boursier G，Siri A，de Boysson H.Use of regulatory T cells in cellular therapies in autoimmune diseases［J］.Med Sci(Paris)，2012，28(8 -9):757 -763.

［4］Zhang Y，Zhang L，Wu J，et al.Heme oxygenase-1 exerts a protective role in ovalbumin-induced neutrophilic airway inflammation by Inhibiting Th17 Cell-mediated immune response［J］.J Biol Chem，2013，288(48):34612 -34626.

［5］Moriya M，Nakatsuji Y，Miyamoto K，et al.Edaravone，a free radical scavenger，ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Neurosci Lett，2008，440(3):323 -326.

［6］Sakaguchi S.Regulatory T cells in the past and for the future［J］.Eur J Immunol，2008，38(4):901 -937.

［7］Zhang L，Zhang Y，Zhong W，et al.Heme oxygenase-1 ameliorates dextran sulfate sodium-induced acute murine colitis by regulating Th17/Treg cell balance［J］.J Biol Chem，2014，289(39):26847-26858.

［8］Zhang Y，Zhang L，Wu J，et al.Heme oxygenase-1 exerts a protective role in ovalbumin-induced neutrophilic airway inflammation by inhibiting Th17 cell-mediated immune response［J］.J Biol Chem，2013，288(48):34612-34626.

［9］Chen SJ，Wang YL，Lo WT，et al.Erythropoietin enhances endogenous haem oxygenase-1 and represses immune responses to ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Clin Exp Immunol，2010，162(2):210 -223.

［10］Xia ZW，Zhong WW，Meyrowitz JS，et al.The role of heme oxygenase-1 in T cell-mediated immunity:the all encompassing enzyme［J］.Curr Pharm Des，2008，14(5):454 -464.