丁苯酞氯化鈉注射液對大鼠延髓缺血后微血管密度、NGF、BDNF 表達的影響

朱 江，竇志杰，王維興，丁 萌，周志強

缺血性腦血管病是各種原因所致腦部血液供應障礙，導致腦組織缺血、缺氧性壞死，出現相應神經功能損傷［1］。缺血后腦組織中微血管的分布密度的變化是反應腦組織血液供應情況的一個重要指標。腦組織血液供應障礙勢必會對神經元及神經營養因子造成相應影響。近年來對缺血性腦血管病損傷機制的認識已進入分子水平［2］，其中神經生長因子(nerve growth factor，NGF)和腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)可以明顯促進缺血后神經元的存活和生長發育，改善神經元的病理狀態，促進受損神經元再生及分化成熟，在中樞神經系統損傷修復過程中具有重要的作用［3］。丁苯酞氯化鈉注射液(butylphthalide)具有清除自由基和神經保護作用，可增強局部腦血流［4］，改善腦缺血后的能量代謝，減輕神經功能損傷的程度［5］。本研究從丁苯酞氯化鈉注射液對大鼠延髓缺血腦組織中NGF 和BDNF 表達的改變及其最終對微血管分布的影響的角度，對丁苯酞氯化鈉注射液在延髓缺血過程中起到的保護作用進行深入的探討。

1 材料和方法

1.1 動物與分組 SPF 級Wistar 成年健康雄性大鼠220～260 g，購于河北醫科大學實驗動物中心。60 只大鼠隨機分為3 組:假手術組、丁苯酞治療組、缺血對照組。其中假手術組每組6 只大鼠，其余按時間點分為7 d、14 d 兩個亞組，每組12 只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 延髓缺血模型制備 結扎右側頸總動脈:10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg)，仰臥固定，頸部正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌，暴露分離出右側頸總動脈并結扎切斷，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1 ×105U/L)沖洗后縫合傷口。電凝椎動脈:大鼠俯臥固定，于后正中線第1頸椎水平處作縱形切口，沿中線分開肌層，暴露第一頸椎橫突孔，將高頻電刀的電凝刀頭插入橫突孔內凝閉椎動脈3～4 s，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1 ×105U/L)沖洗后縫合傷口。待清醒后，單籠保溫喂養。

1.2.2 實驗動物的干預方法 假手術組只暴露雙側椎動脈及右側頸總動脈，不做血管阻斷處理。治療組、缺血對照組均在阻斷雙側椎動脈及右側頸總動脈后立即開始治療。治療組每天腹腔注射丁苯酞氯化鈉注射液兩次，時間間隔12 h，每次注射計量按3 mg/kg 計算，到術后7 d 和14 d 兩個時間點分別處死，取延髓。缺血對照組每天腹腔注射生理鹽水兩次，時間間隔12 h，注射劑量為0.5 ml/次。到術后7 d 和14 d 兩個時間點分別處死，取延髓。

1.2.3 實驗標本制作 應用10%水合氯醛(350 mg/kg)，腹腔注射。仰臥位固定于鼠板上，快速剪開腹腔和胸腔的前壁，清晰的暴露出心臟，用連有輸液管的預先處理為鈍圓的針頭插入左心室內，快速輸入溫生理鹽水(37 ℃)100 ml，同時用眼科剪剪破右心耳，此時血液由右心耳處流出，待大鼠四肢末端變白，換上4%多聚甲醛(0.1 mol 磷酸鹽緩沖液配成pH 7.4)灌流固定。灌流結束后取出延髓，用冰生理鹽水沖洗，除去血液。石蠟包埋切片。

1.2.4 觀察指標 (1)單寧酸-氯化鐵媒染法觀察微血管密度:每只大鼠取3 張切片，采用Simple PCI-8 圖像分析軟件分析腦組織微血管灰度。每張切片在光鏡下選5 個視野，取平均灰度值進行統計學分析。該分析儀器的灰度級為0～256 灰級，平均灰度表示陽性細胞的反應強度，平均灰級越高，說明反應強度越低。(2)神經營養因子:NGF、BDNF 蛋白表達的測定用SP 免疫組織化學染色法，所有切片染色均采用相同條件，每批染色均設陰性對照。陰性對照用PBS 替代一抗孵育切片。結果判定:陽性細胞的胞漿、胞膜、軸突呈棕黃色著色。圖像分析:用Simple PCI-8 圖像分析軟件對圖像進行統計學分析。每張切片在光鏡下選5 個視野，取平均灰度值進行統計學分析。該分析儀器的灰度級為0～256灰級，平均灰度表示陽性細胞的反應強度，平均灰級越高，說明反應強度越低。

1.2.5 統計學處理 用SPSS 13.0 統計軟件包處理，數據用均數±標準差()表示，組間比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 有統計學意義。

2 結果

2.1 各組腦組織中NGF、BDNF 灰度值的變化通過對7 d、14 d 后實驗動物的觀察，治療組及缺血對照組中灰度值較假手術組顯著增加。但是，治療組NGF、BDNF 灰度值增加的程度低于缺血對照組NGF、BDNF 灰度值增加的程度。其中，治療組各時段NGF、BDNF 灰度值均低于缺血對照組。與假手術組比較有統計學差異(見表1、表2)。

2.2 各組腦組織中微血管灰度的變化 通過對7 d、14 d 后實驗動物的觀察，治療組及缺血對照組的微血管灰度值較假手術組均增加。治療組數值增加的幅度低于缺血對照組。其中，治療組微血管灰度值在各時段均低于缺血對照組。與假手術組相比較二者均有統計學差異(見表3)。

表1 各組大鼠腦組織中NGF 蛋白陽性表達灰度值比較()

表1 各組大鼠腦組織中NGF 蛋白陽性表達灰度值比較()

與假手術組比較* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

表2 各組大鼠腦組織中BDNF 蛋白陽性表達灰度值比較()

表2 各組大鼠腦組織中BDNF 蛋白陽性表達灰度值比較()

與假手術組比較* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

表3 各組大鼠腦組織中微血管灰度值比較()

表3 各組大鼠腦組織中微血管灰度值比較()

與假手術組比較* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

3 討論

BDNF 和NGF 具有多種生物活性，廣泛分布于中樞神經系統。腦缺血后，腦神經元損傷的程度與BDNF 和NGF 的表達水平密切相關［6，7］。腦缺血后，BDNF、NGF 均增加［8］，通過拮抗興奮性氨基酸毒性，穩定細胞內鈣離子濃度，增強蛋白激酶活性，保護神經元，促進神經元的修復［9］。

在延髓缺血后，出現神經元數量及微血管密度的減少，神經膠質細胞數量的增加。在缺血條件下，神經膠質細胞大量增生填充于壞死區域，引起局部微循環障礙，即微血管凋亡的數量大于其新生的數量［10，11］。研究發現BDNF 促進內皮細胞的分化與分裂，刺激神經血管的生成［12］。

丁苯酞是一種新型抗腦缺血藥物，可通過解除微血管痙攣、抑制血小板聚集，抑制TXA2 的合成等多個環節阻斷腦缺血引起的病理過程。丁苯酞能清除自由基，抑制脂質過氧化反應，保護血管內皮細胞和神經元［13］，提高BDNF、NGF 水平，進一步影響血管新生數量。

本研究發現，在延髓缺血狀態下，與假手術組相比較，治療組微血管灰度值增加的程度明顯低于缺血對照組;治療組NGF、BDNF 的灰度值增加的程度明顯低于缺血對照組;與缺血對照組相比較，丁苯酞氯化鈉注射液治療7 d、14 d 時微血管灰度降低趨勢與BDNF、NGF 灰度值降低趨勢呈正相關。通過實驗發現，在腦組織慢性缺血的前提下，治療組中NGF、BDNF 表達水平升高，提示丁苯酞氯化鈉注射液不僅具備清除自由基的作用，還可以通過激發神經生長因子途徑對神經元起到保護作用。更重要的是，微血管密度增加可從根本途徑上改善腦組織缺血造成的損傷。同時提示微血管密度增加可促進NGF、BDNF 的表達，神經生長因子又進一步刺激微血管新生，即二者之間是相互促進的正性刺激過程。

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