白介素1β 單克隆抗體對癲癇致大鼠海馬組織炎癥反應的影響

張海清，孔慶霞

癲癇(epilepsy)是大腦神經元異常放電導致的短暫性大腦功能障礙。近年來研究發現，炎癥反應與癲癇的關系密不可分，腦內特定區域的炎癥反應是其共同的本質特征［1］，炎癥反應可以降低癇性發作的閾值、增加神經元興奮性、破壞血腦屏障、介導神經元凋亡及突觸重塑［2］。在多種癲癇動物模型中均觀察到與癲癇活動相關的腦區中膠質細胞活化、炎性因子水平增高，包括白細胞介素-1β (IL-1β)、白細胞介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-α (TNFα)等細胞因子的釋放［3］。在難治性癲癇患者手術切除腦組織及癲癇動物模型中均證實存在IL-1β 表達水平異常升高，Mattia 等發現患者腦組織中IL-1β升高水平與其術前癇性發作的嚴重程度成正相關［4］。有研究顯示給予IL-1 受體拮抗劑(IL-1ra)或者抑制IL-1β 前體轉化酶活性(pralnacasan 或VX-765)能有效發揮抗癇作用，但是不能改善癲癇造成的病理改變，考慮與不能完全抑制IL-1β 的生物活性有關［5］。本實驗通過氯化鋰-匹羅卡品建立顳葉癲癇模型，通過IL-1β 單克隆抗體中和IL-1β，觀察IL-1β 單克隆抗體對大鼠癲癇IL-1β mRNA、核轉錄因子NF-κB mRNA、神經損傷標志物S100B、膠質細胞活化及神經元凋亡的影響，旨在探討IL-1β 單克隆抗體對氯化鋰-匹羅卡品誘導的癲癇大鼠海馬組織炎癥反應的作用及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料及實驗分組 健康雄性Sprague Dawley 大鼠72 只(山東魯抗實驗動物中心，生產許可證scxk 魯20130001)，體重250～300 g。按隨機數字表法將大鼠分為正常對照組(20 只)、模型組(26 只)、IL-1β 單克隆抗體治療組(26 只)。匹羅卡品、氯化鋰(美國SIGMA);IL-1β 單克隆抗體(美國R＆D)、無標記兔抗小鼠抗體(武漢博士德)、HRP 標記羊抗兔(武漢博士德)、兔抗大鼠GFAP-Cy3 標記(美國abcam)、兔抗大鼠Iba1(日本wako)、FITC 標記驢抗兔二抗(美國abcam);總RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒(北京天根生物科技)，引物由上海生物工程有限公司設計合成;BIO-RAD 凝膠成像系統(美國BIO-RAD);Leica 熒光顯微鏡(德國萊卡);大鼠S100B ELISA 試劑盒(武漢華美)。

1.2 動物模型制備 氯化鋰-匹羅卡品法制備癲癇模型，方法如下:大鼠腹腔內提前18～20 h 預先注射氯化鋰(LiCl)127 mg/kg，第2 天提前30 min預先給予大鼠腹腔注射溴化甲基阿托品1 mg/kg，30 min 后實驗組腹腔注射新鮮配置的匹羅卡品(PILO)30 mg/kg(對照組注射0.9%的生理鹽水)。大鼠在匹羅卡品注射后可在外周出現外周膽堿能反應、刻板動作、癲癇發作直至全身強直-陣攣癲癇大發作。按照Racine 癲癇行為標準觀察記錄大鼠行為30 min，若大鼠未達到Racine 分級的IV～V 級的癇性發作，則可以追加匹羅卡品的劑量，每隔10 min重復注射匹羅卡品一次，每次為10 mg/kg，最大追加劑量可達60 mg/kg。只有發作級別達Racine 分級IV～V 級才能進入后續實驗。治療組分別于造模后30 min、7 d、14 d 腹腔注射單克隆抗體(20 μg/ml)［6］，癲癇組和正常對照組分別給予等量生理鹽水。對造模失敗大鼠通過隨機抽樣原則作及時補充，以保證各實驗組大鼠數量恒定。模型組、治療組給藥在72 h、21 d 后各隨機取3 只提取海馬組織蛋白測定海馬區IL-1β 單克隆抗體濃度。各組大鼠在造模后72 h 隨機取10 只用RT-PCR 檢測海馬組織中IL-1β、NF-κB 表達水平以及用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清中S100B 含量，在造模后21 d 每組剩余10 只利用免疫熒光法和尼氏染色分別檢測海馬區膠質細胞活化和神經元凋亡情況。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 組織取材及處理 各組大鼠于各觀察時間點采用10%水合氯醛(0.3～0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位，四肢稍固定。對于各組中造模72 h 取材的大鼠，首先局部消毒后打開腹腔，輕柔撥開臟器暴露腹主動脈，用5 ml 注射器取血，將血注入促凝管中，室溫靜止2 h 后離心取上清，-80 ℃凍存備用。治療組中隨機取3 只大鼠，腹主動脈取血后立即脫頸處死大鼠，斷頭取出大腦，并且立即冰上分離獲取海馬，將海馬迅速放入液氮中保存，用于提取蛋白、測定海馬組織中IL-1β 單克隆抗體濃度。各組中隨機取10 只用于提取組織RNA。造模21 d各組大鼠采用上述方式麻醉，依次以0.9%生理鹽水及4%多聚甲醛經心臟灌注固定，分離腦組織置于4% 的多聚甲醛中繼續固定12 h(4 ℃)，后經30%蔗糖脫水沉底，行冰凍連續冠狀位切片，切片厚15 μm/5 μm，分別用于免疫熒光染色和尼氏染色。

1.3.2 免疫蛋白印記(Western blot) 冰上研磨海馬組織，加入裂解液及蛋白酶抑制劑(RIPA)充分裂解細胞，冰上研磨40 min，離心組織勻漿4 ℃12000 r/min ×30 min，取上清，即為得到組織總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度。所得蛋白質熱變性備用。各組分別取50 μg 進行SDS-PAGE 電泳，濕轉法轉膜并封閉，與無標記兔抗小鼠抗體一抗4 ℃孵育過夜，TBS-T 洗去一抗后加二抗孵育2 h，用ECL顯影，在BIO-RAD 凝膠成像系統圖像分析系統曝光并定量分析條帶的光密度值。

1.3.3 熒光定量PCR(RT-PCR) 用Trizol 試劑提取大鼠海馬組織總RNA，研缽中加液氮研磨海馬組織，組織研磨至粉末狀時按RNA 提取試劑盒說明書提取海馬組織總RNA，逆轉錄為cDNA，以1μl cDNA 為模板行PCR 擴增，實時定量PCR 樣品反應體系采用SYBR Green I，其最終的反應體系20 μl。IL-1β 上游引物:5’-GCCAACAAGTGGTATTCTCCA-3’，下游引物:5’-TGCCGTCTTTCATCACACAG-3’;NF-κB 上游引物:5’-TGGGACGACACCTCTACACA-3’，下游引物:5’-GGCTCAAAGTTCTCCACCAG-3’;β-actin 上游引物:5’-CATCACTATCGGCAATGAGC-3’，下游引物:5’-GACAGCACTGTGTTGGCATA-3’。PCR 循環條件為:95 ℃15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃32 s，40 個循環。每個樣品均設置相應未經逆轉錄的模板作為陰性對照，繪制IL-1β、NF-κB、β-actin 的熒光曲線和溶解曲線，并得到各自的熒光域值循環數(Ct 值)，采用相對定量法2-△△Ct 進行計算實驗組相對與對照組的基因表達量。

1.3.4 ELISA 嚴格參照ELISA 試劑盒說明書檢測血清中S100B 含量，以空白調零，450 nm 波長檢測各孔光密度D(λ)值。

1.3.5 免疫熒光染色 將冰凍切片常溫下復溫30 min，加5%山羊血清封閉2 h，加入抗GFAP(Cy3 標記)及Iba1 一抗4 ℃孵育過夜，PBS 洗3次，加入FITC 標記驢抗兔二抗，避光室溫條件孵育1 h，PBS 洗凈后加入DAPI 染色3 min，PBS 洗3 次，抗熒光衰減封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.6 尼氏染色 將冰凍切片常溫下復溫30 min，PBS 漂洗3 次，1%甲苯胺藍65 ℃下染色10 min，蒸餾水漂洗，將切片浸入95%鹽酸乙醇中分色，鏡下監視分色至滿意效果;蒸餾水沖洗，梯度脫水，二甲苯透明(5 min×2 次)，中性樹脂封片;鏡下觀察并進行海馬區域神經元計數。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0 統計軟件分析數據。實驗結果以均數±標準差()表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 認為差異有統計學意義，兩組間均數比較采用兩獨立樣本t 檢驗，P ＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模情況 實驗組大鼠腹腔注射匹羅卡品10～40 min 后開始出現外周膽堿能反應，隨后出現癲癇發作:咀嚼或動須、節律性點頭、濕狗樣抖動、前肢及后肢痙攣、最后出現全身強直-痙攣發作并跌倒。按照Racine 分級標準，只有達到IV 級及以上的大鼠進入后續試驗，癲癇達IV 級以上發作后1h腹腔注射水合氯醛終止其發作。造模成功率為85.29%，死亡率10.34%(68 只大鼠，58 只成功建立模型，其中4 只在造模后24 h 內死亡，2 只在造模后48 h 內死亡)，模型成功后注意保暖，加強呼吸道及體液管理能有效降低模型死亡率。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水，無任何抽搐表現，行為正常。

2.2 免疫蛋白印記Western blot 檢測治療組海馬區IL-1β 單克隆抗體的濃度 模型組大鼠海馬組織中僅檢測到少量IL-1β 抗體，考慮與抗體的交叉反應有關，治療組中給藥后72 h、21 d 后大鼠海馬組織中IL-1β 單克隆抗體的濃度明顯高于模型組(見圖1)。與標準濃度比較發現不同時間點治療組中IL-1β 單克隆抗體的濃度均＞3.00 μg Ab/g。

2.3 熒光實時定量PCR(RT-PCR)檢測海馬組織IL-1β、NF-κB mRNA 的表達 采用2-△△Ct(RQ)法計算目的基因相對表達率。從擴增曲線和溶解曲線中可以看出，熒光定量PCR 反應中目的基因及內參得到了擴增，并且擴增產物單一，所得實驗結果可信。統計結果顯示模型組IL-1β、NF-κB mRNA 表達量均顯著高于正常對照組，差異有統計學意義(P ＜0.05)。與模型組相比，治療組中IL-1β、NFκB mRNA 表達量均有明顯下降，分別較模型組下降42.11%、35.32%，差異有統計學意義(P ＜0.01)。

2.4 ELISA 檢測各組大鼠血清中S100B 含量正常對照組大鼠血清中S100B 蛋白水平較低，模型組與正常對照組比較血清中S100B 蛋白水平明顯升高(P ＜0.05)，治療組與模型組比較血清S100B 蛋白水平明顯下降(P ＜0.01)。

2.5 免疫熒光雙重染色法觀察海馬區膠質細胞活化情況 免疫熒光顯微鏡(×400 倍)下觀察，造模后21 d，與對照組比較模型組海馬CA3區GFAP與Iba1 陽性細胞增多，星形膠質細胞(紅色)和小膠質細胞(綠色)增生現象顯著(P ＜0.05)，差異有統計學意義。治療組GFAP 與Iba1 陽性細胞較模型組明顯減少(P ＜0.01)(見表1、圖2)。

2.6 尼氏染色法觀察海馬區神經元缺失情況正常對照組中神經元排列整齊、形態完整。與對照組相比，模型組海馬CA3區神經元數目減少(P ＜0.05)，錐體細胞排列紊亂，可見部分形態不完整，胞漿內尼氏小體減少。與模型組相比，治療組海馬CA3區神經元缺失情況明顯減輕(P ＜0.05)，其他病理形態學改變相對減輕(見表2)。

表1 各組大鼠海馬CA3區膠質細胞數目()

表1 各組大鼠海馬CA3區膠質細胞數目()

與正常組比較* P ＜0.05;與模型組比較#P ＜0.01

表2 各組大鼠海馬CA3區神經元數目()

表2 各組大鼠海馬CA3區神經元數目()

與正常組比較* P ＜0.05;與模型組比較#P ＜0.05

圖1 IL-1β 單克隆抗體在海馬組織中濃度

3 討論

天然免疫反應又稱為固有免疫反應，是機體防御病原體的第一道防線。吞噬細胞通過模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別病原相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，促進多種炎性細胞因子釋放及炎癥反應。IL-1 介導的信號轉導途徑是組織炎癥反應的開始，IL-1β 作為上游炎性因子能介導多種炎性因子表達上調，因此IL-1β 被稱為“前炎性因子”。國內外研究均證實癲癇與IL-1β 有密切的關系，IL-1β 增加癇性發作主要通過以下機制:(1)能夠促進谷氨酸釋放、抑制其重吸收［7］，谷氨酸作為一種興奮性神經介質能降低癇性發作閾值;(2)介導NMDA 受體NR2B 受體磷酸化，促進神經元鈣離子內流，細胞內鈣超載介導神經元損傷［8］;(3)抑制GABA 受體介導的Cl-外流［9］，進而減少GABA 受體介導的抑制性信號傳遞。IL-1β 成熟過程包括兩個步驟:(1)在核轉錄因子NF-kappa B(NF-κB)的誘導下IL-1β mRNA 表達上調［10］，使其釋放增多，除此之外，NF-κB 能促進多種炎性介質的基因轉錄增加，從而導致炎癥反應的瀑布式級聯擴大;(2)IL-1β mRNA 翻譯后為無生物活性的IL-1β 前體，IL-1β 前體必須經過半胱天冬氨酸酶1(caspase-1)活化、切割為具有生物活性的IL-1β［11］，因此caspase-1 是IL-1β 成熟的關鍵酶。IL-1 受體拮抗劑(IL-1ra)或者抑制caspase-1 活性能有效發揮抗癇作用［4］。盡管抑制caspase-1 活性能抑制IL-1β 合成，但是并不能完全抑制其合成。這可能與細胞內存在潛在“IL-1β 前體儲存池”，抑制caspase-1活性后仍可以在其他酶的催化下以低轉化率生成IL-1β［11］。因此抑制caspase-1 活性并不能完全阻斷IL-1β 介導的信號通路、炎癥反應。

本實驗中我們選用IL-1β 單克隆克隆抗體中和IL-1β 以求達到抑制炎癥反應的作用。長久以來一致認為，抗癇藥物能否有效通過血腦屏障是治療癲癇的關鍵。有研究顯示靜脈、皮下或者腹腔給予抗體類藥物(如抗β-淀粉樣蛋白抗體、抗胰島素樣生長因子-1 抗體、抗干擾素抗體)均能通過血腦屏障［12，13］。Clausen 等研究發現，腹腔注射IL-1β 單克隆抗體能有效通過血腦屏障，并且能維持較長半衰期［6］。體外實驗證實對于中和100 pg/ml 的IL-1β其所需IL-1β 單克隆抗體半數有效濃度為300 ng/ml［14］，通過蛋白質印記法我們檢測到海馬組織中IL-1β 單克隆抗體顯著高于有效濃度(＞3.00 μg Ab/g)。本實驗結果顯示:正常對照組大鼠海馬區神經元無缺失，膠質細胞無明顯活化，海馬組織中IL-1β、NF-κB mRNA 表達水平低，血清中S100B 蛋白含量少;與模型組比較，治療組大鼠神經元缺失、膠質細胞活化情況得到改善，海馬組織中IL-1β、NF-κB mRNA 表達水平減弱，血清中神經損傷標志物S100B 蛋白含量下降，提示IL-1β 單克隆抗體能有效通過血腦屏障，直接中和異常升高的IL-1β，同時阻斷IL-1β 介導的NF-κB 轉錄水平升高，減輕IL-1β 炎癥反應、神經元缺失及膠質細胞活化，而起到神經保護作用。但是IL-1β 單克隆抗體能否有效全面抑制癲癇導致的炎癥反應尚不清楚，仍需進一步研究。

圖2 各組大鼠海馬星形膠質細胞、小膠質細胞活化情況

綜上所述，IL-1β 單克隆抗體能有效通過血腦屏障，直接中和異常升高的IL-1β 及阻斷IL-1β 介導的NF-κB 轉錄水平升高，減輕IL-1β 炎癥反應而起到神經保護作用，IL-1β 單克隆抗體對癲癇有效的神經保護作用為癲癇治療提供新思路。

［1］Vezzani A，French J，Bartfai T，et al.The role of inflammation in epilepsy［J］.Nat Rev Neurol，2011，7(1):31 -40.

［2］Xu D，Miller SD，Koh S.Immune mechanisms in epileptogenesis［J］.Front Cell Neurosci，2013，7:195.

［3］Vezzani A，Aronica E，Mazarati A，et al.Epilepsy and brain inflammation［J］.Exp Neurol，2013，7(244):11 -21.

［4］Mattia M，Silvia B，Teresa R.Interleukin-1beta biosynthesis inhibition reduces acute seizures and drug resistant chronic epileptic activity in mice［J］.Neurotherapeutics，2011，8(2):304 -315.

［5］Ravizza T，Lucas SM，Balosso S，et al.Inactivation of caspase-1 in rodent brain:a novel anticonvulsive strategy［J］.Epilepsia，2006，47(7):1160 -1168.

［6］Clausen F，Hnell A，Israelsson C，et al.Neutralization of interleukin-1 beta reduces cerebral edema and tissue loss and improves late cognitive outcome following traumatic brain injury in mice［J］.Eur J Neurosci，2011，34(1):110 -123.

［7］Bezzi P，Domercq M，Brambilla L，et al.CXCR4-activated astrocyte glutamate release via TNFalpha:amplification by microglia triggers neurotoxicity［J］.Nat Neurosci，2001，4(7):702 -710.

［8］Viviani B，Bartesaghi S，Vezzani A，et al.Interleukin-1 beta enhances NMDA receptor-mediated intracellular calcium increase through activation of the Src family of kinases ［J］.Neurosci，2003，23(25):8692 -8700.

［9］Wang S，Cheng Q，Malik S，et al.Interleukin-1beta inhibits gamma-aminobutyric acid type A GABA(A)receptor current in cultured hippocampal neurons［J］.Pharmacol Exp Ther，2000，292(2):497-504.

［10］Dinarello A.Biologic basis for interleukin-1 in disease［J］.Blood，1996，87(6):2095 -2147.

［11］Dinarello A.Immunological and inflammatory functions of the interleukin-1 family［J］.Annu Rev Immunol，2009，27:519 -550.

［12］Glasper R，Llorens-Martin MV，Leuner B，et al.Blockade of insulin-like growth factor-I has complex effects on structural plasticity in the hippocampus［J］.Hippocampus，2010，20(6):706 -712.

［13］Sas A，Jones R.Tyor W.Intra-peritoneal injection of polyclonal antiinterferon alpha antibodies cross the blood brain barrier and neutralize interferon alpha［J］.Neurochem Res，2008，33(11):2281-2287.

［14］Alten R，Gram H，Joosten A.The human anti-IL-1 beta monoclonal antibody ACZ885 is effective in joint inflammation models in mice and in a proof-of-concept study in patients with rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Res Ther，2008，10:R67.