MMP-2 基因多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死初發及復發相關性研究

李 鳳，陳 明，喻 明，李琳琳，聶本剛

腦梗死是指腦部血液供應障礙，腦組織缺血缺氧導致壞死，從而出現相應的神經功能缺損，占全部卒中的60%～80%［1］，動脈粥樣硬化是其最常見的病因［2］。首發的腦梗死患者，能及時治療，多數能夠進入到恢復期和后遺癥期繼續治療，而腦梗死一旦復發，其癥狀重于初發，愈發難治并危及生命。在我國，腦梗死5 y 內的平均復發率高達40%以上。如何防止腦梗死復發，是當今國內外研究的一個重要課題。腦卒中與遺傳多態性的研究是近年生命科學研究的熱點和重點。家族聚集性研究、雙生子研究、家系的復合分離分析和遺傳模式分析等多種研究方法結果表明腦卒中符合多基因遺傳方式，盡管國內、外已廣泛開展該病的分子遺傳學研究，但得到公認的陽性結果不多，各研究結論亦難以互相重復或驗證［3］。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一種可降解細胞外基質的鈣鋅離子依賴性蛋白酶，一直被認為是動脈粥樣硬化發病中的一種重要炎癥介質，可促進動脈粥樣硬化的發生與發展。MMP-2 是MMPS 家族的主要成員，與缺血性腦卒中的發生發展密切相關［4］。而MMP-2 基因1306C/T 和735C/T 多態性與動脈粥樣硬化有關，基因失活對輕微損傷引起的血栓形成有保護作用，并中度延長出血時間［5］。目前國內外尚未見MMP-2 基因1306C/T 和735C/T 多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死初發及復發的相關性研究的文獻報道。本研究旨在探討MMP-2 基因1306C/T 和735C/T 多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死初發及復發的相關性，為腦梗死的預防及治療提供新的理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 篩選2012 年4 月～2014 年4月在本院神經內科連續住院的腦梗死患者。入選方法:(1)初發腦梗死患者:在我院住院，確診為首次發生腦梗死患者;(2)復發腦梗死患者:在我院住院患者，既往有腦梗死病史;(3)正常健康組:在我院體檢科體檢的正常人群。入選標準:全部入選病例符合1995 年全國第四屆腦血管病學術會議制定的診斷標準［5］，年齡≥18 歲，腦梗死發病3 d 內入院，并經臨床、頭部CT 和/或MRI 掃描確診，所有病例組行頸部血管彩超檢查，部分患者行頭部MRA 檢查，根據TOAST 分型標準［6］選出大動脈粥樣硬化性腦梗死患者。其中復發性腦梗死同時需滿足:(1)出現新的神經功能缺損癥狀;(2)初發癥狀加重，距第一次梗死時間大于一個月，排除進展性卒中;(3)影像證實有新的缺血病灶。排除標準:(1)不合作者，患者或家屬不同意參與該研究或拒絕留取標本;(2)有動脈炎和其他血管炎、腦動脈畸形和心源性腦栓塞;(3)有嚴重的呼吸系統感染或其他嚴重感染疾病;(4)有嚴重的肝臟疾病和(或)肝功能損害者;(5)有嚴重的腎臟疾病和(或)腎功能損害者，經腎功能檢查提示Cr ＞220 μmol/L;(6)有嚴重貧血者，經血常規檢測提示Hb ＜80 g/L，或者凝血功能障礙或其他嚴重的血液系統疾病;(7)近期有外傷史、手術史、妊娠史、傳染性疾病以及寄生蟲疾病史;(8)近6 個月來有服用降脂藥治療和(或)雌激素及避孕藥史;(9)有嚴重的內分泌疾病、自身免疫性疾病和(或)惡性腫瘤。所有研究對象間無血緣關系，在納入研究前每位入組者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法 所有患者于入院次日清晨空腹抽血檢測血糖、血脂等水平，酶聯免疫吸附法(美國R＆D 公司試劑盒)檢測血清MMP-2 水平。MMP-2 基因1306C/T 和735C/T 多態性檢測采用PCR 限制性片段長度多態性技術。(1)DNA 提取:清晨空腹抽取的肘靜脈血置于抗凝管中，-80 ℃冰箱凍存。采用血液基因組提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)抽提基因組DNA。(2)引物的設計及合成:運用Primer5.0 軟件(加拿大Premier公司)進行引物設計，由上海生物工程有限公司合成。MMP-2 基因735C/T 上游引物序列:5’-ATCCTGTGACGGAGAATG-3’，下 游 引 物 序 列:5’-TAAAATGAGGCTGAGACC-3’，擴增片段長度為164 bp。MMP-2 基因1306C/T 上游引物序列:5’-CTTACCCCGAGTCCTATCTGCC-3’，下游引物序列:5’-TCTTGGGAACGCCTGACTTCAG-3’，擴增片段長度為193 bp。(3)PCR 反應條件95 ℃5 min，(94 ℃45 s，56℃ 30 s，72 ℃ 35 s) × 30 cycles，72 ℃10 min。PCR 反應體系為10 ×buffer 2 μl，dNTP(各10 mmol/L)1 μl，上下游引物各1 μl，DNA 模板0.1 μg，DNA 聚合酶2 U，加ddH2O 至總體積20 μl。反應結束后，經2%瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像儀檢測PCR 產物特異性，PCR 純化試劑盒(德國Qiagen 公司)純化PCR 產物。(4)酶切反應:反應體系包括PCR 純化產物1 μg，10 ×buffer 1 μl，XspⅠ內切酶1.5 U(1306C/T)或HinfⅠ內切酶1.5 U(735C/T)(New England Biolabs 公司)，加ddH2O 至10 μl 體積，置于37 ℃酶切16 h，經2%瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像儀判定結果。

1.2.2 統計方法 所有數據運用SPSS 17.0統計軟件，釆用Hardy-Weinberg 平衡法檢測樣本的群體代表性。所測數值以均數±標準差()描述，計數資料以百分率(%)表示，各組之間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)的多個樣本均數兩兩比較法(LSD 法)，兩樣本均數比較采用成組設計的兩樣本均數比較(t 檢驗)，并以比值比(odds ratio，OR)及其95%的置信區間(confidence index，CI)表示相對風險度。綜合評價各因素與初發腦梗死、復發腦梗死的相關性采用多因素Logistic 回歸分析。P ＜0.01，差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料 最終入組初發腦梗死350 例，復發腦梗死340 例，正常健康組(對照組)360 例。3 組一般臨床資料比較如下(見表1)。

2.2 3 組血清MMP-2 水平的比較 初發腦梗死組及復發腦梗死組血清MMP-2 水平顯著高于對照組，且復發腦梗死組高于初發腦梗死組［(3.32 ±0.94)vs (2.93 ±0.53)mg/L，P ＜0.01］。以表1中所有的變量作為自變量(有=1，無=0)，是否發生腦梗死為因變量(發生腦梗死=1，對照組=0)進行Logistic 回歸分析，結果顯示血漿MMP-2 水平增高不是發生腦梗死的獨立危險因素(OR 0.820，95%CI 0.620～1.058，P ＞0.01;OR:0.719，95%CI:0.528～1.016，P ＞0.05)。

2.3 3 組MMP-2 基因多態性檢測結果 對照組、初發腦梗死組及復發腦梗死組人群MMP-2 基因1306C/T(χ2=0.523，P ＞0.05)和735C/T(χ2=0.891，P ＞0.05)多態性分布符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。(1)3 組MMP-2 1306C/T基因型(χ2=1.075，P ＞0.01)和等位基因(χ2=1.124，P ＞0.01)的頻率分布無統計學意義(見表2)，PCR 擴增產物經XspⅠ內切酶酶切為CC 基因型可見188 bp 的基因片段，CT 型可見188、162 bp2個基因片段，TT 基因型可見162 bp 的基因片段。(2)735C/T 基因:PCR 擴增產物經HinfⅠ內切酶酶切為3 種基因型:純合子C/C(僅有164 bp 一條帶);雜合子C/T(可見164 bp、143 bp、68 bp3 條帶)，純合突變子T/T(可見143 bp、68 bp 兩條帶)。復發腦梗死組C 等位基因頻率明顯升高，與初發腦梗死組相比(92.5% vs 87.9%，χ2=4.398，P ＞0.01)差異無統計學意義，但與對照組相比(92.5%vs 78.5%，χ2=8.121;P ＜0.01)差異有統計學意義;初發腦梗死組與對照組相比(87.9% vs 78.5%，χ2=4.121;P ＞0.01)差異無統計學意義(見表3)。以MMP-2 735C/T 基因型作為自變量(CC=1，CT=0)，是否發生腦梗死為因變量(發生腦梗死=1，正常對照組=0)進行Logistic 回歸分析，MMP-2 735C/T 多態性是腦梗死復發的獨立危險因素(OR:1.765，95%CI:1.177～2.676，P=0.006)。

表1 研究對象的一般資料比較

表2 3 組人群MMP-2 1306C/T 基因型及等位基因頻率分布(例，%)

表3 3 組人群MMP-2 735C/T 基因型及等位基因頻率分布(例，%)

3 討論

腦梗死是一個多基因遺傳疾病，到目前為止關于腦梗死確切的發病機制及病理生理過程仍然不清楚。隨著生活水平的提高及人口老齡化的加劇，腦梗死發生及復發越來越多。目前如何防止腦梗死發生及復發存在很大的問題。已有的研究［7，8］發現MMP-2 與血管再生、炎性反應存在密切相關性，在腦梗死的發生發展中起重要的作用。MMP-2 可特異性的降解膠原、彈性蛋白和纖維蛋白，削弱動脈粥樣硬化斑塊的穩定性，裂解基底膜及血腦脊液屏障，參與血管內膜的聚集、浸潤和活化，從而導致動脈粥樣硬化斑塊破裂，參與梗死后炎癥反應、繼發性腦損傷及損傷的神經修復過程［9］。Brouns 等發現腦梗死患者在急性期MMP-2 明顯增加，促進細胞外基質降解，造成血腦屏障開放和血管通透性增加，導致血管源性腦水腫［10］。Halder 等則發現MMP-2 水平與腦梗死后神經功能缺損程度之間呈現出一定相關性［11］。Stemlich等發現MMP-2 在腦卒中發生的4 個月甚至數年后仍然表達增高［12］。本研究顯示兩組動脈粥樣硬化性腦梗死組患者的血清MMP-2 水平均顯著高于正常組，且復發腦梗死組高于初發腦梗死組，提示MMP-2 參與了腦梗死的發生，與先前的研究相一致。

人類MMP-2 基因位于染色體16q13～21，分子量為72 kD，包含13 個外顯子和12 個內含子。已發現在MMP-2 基因中存在多個序列變異，其中關于1306C/T 和735C/T 多態位點的研究報道較少。MMP-2 1306C/T 和735C/T 多態變異性是指MMP-2基因轉錄啟動子上游的1306 處和735 處存在的C被T 取代。啟動子直接參與基因的轉錄調控，這些多態性的發生可能會對MMP-2 的轉錄能力產生直接的影響。MMP-2 1306C/T 存在的連鎖不平衡現象導致了1306T 單體型的出現，與1306T/735T 單體型相比，攜帶1306C/735C 單體型的組織中MMP-2 mRNA 水平明顯增高。以往的研究對735C/T 進行功能分析后發現735C→T 改變了Sp1(CCACC 盒)的結合位點，從而導致基因的轉錄活性降低。認為MMP-2 基因的多態性影響血清MMP-2 的水平，進而影響了疾病的發生發展。Manso［13］等發現MMP-2 基因多態性與腦梗死3 個月后的轉歸相關。另外的研究則發現在動脈粥樣硬化的早期階段，即血管重建和血管增厚發生時，MMP-2 1306C/T 和735C/T 位點的多態性與頸動脈內膜中層厚度無直接關系。本研究發現MMP-2 基因1306C/T 的基因型和等位基因的頻率分布在3 組之間比較差異無統計學意義(P ＞0.01)。而MMP-2 基因735C/T 的CC 基因型和C等位基因頻率在腦梗死組明顯高于對照組，且復發腦梗死組高于初發腦梗死組，差異有統計學意義(P＜0.01)，提示MMP-2 735C/T 的C 等位基因可能是腦梗死復發的潛在危險因素。推測其中可能的機制為MMP-2 735C/T 的C 等位基因頻率在復發腦梗死組明顯高于另外兩組，致使基因轉錄活性增加，引起梗死區MMP-2 表達上調，在局部聚集的MMP-2 一方面通過降解血管壁細胞外基質，誘導巨噬細胞增值形成泡沫細胞引起血管壁的炎性反應，促進動脈粥樣硬化斑塊形成;另一方面還可破壞斑塊表面的纖維帽，促進動脈粥樣斑塊的破裂，繼發血栓形成和機化導致動脈粥樣硬化損傷的快速進展和斑塊擴大，造成再次腦梗死。同時，腦血腦屏障破壞、血管通透性增高、局部升高的MMP-2 進入外周循環系統，致使血清MMP-2 水平也升高。

綜上所述，本研究結果表明MMP-2 基因735C/T的C 等位基因是腦梗死遺傳易感基因之一，可能是腦梗死復發的潛在危險因素。本實驗存在樣本量偏小等不足之處，繼續收集臨床病例擴大樣本量將有助于進一步了解MMP-2 基因多態性與腦梗死的關系，為腦梗死的預防和治療提供新的理論依據。

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