酵母電擊轉化效率影響因素研究

王紅日等

摘要：以酵母EGY48為材料，研究了不同培養時間（12、16、20、24、30h）、細胞狀態（OD600）、電擊電壓（600、800、1000、1200、1400V）及不同質粒DNA用量（1、2、5、10、15、20μg）對酵母電擊轉化效率的影響。結果表明：當培養時間為20h、OD600=1.4、電擊電壓為1000V、質粒用量為5μg時，該系統轉化效率最高，為后續高效文庫的篩選奠定了基礎。

關鍵詞：酵母；電擊轉化；轉化效率

中圖分類號：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）01-0029-03

酵母菌（Saccharomycescerevisiae）作為單細胞真核生物，是傳統食品工業的主要用菌，近年來更是低等真核生物基因工程表達的重要菌種。由于具有生長快、易于培養和遺傳操作、具有比大腸桿菌更完備的基因表達調控機制和對表達產物加工修飾及分泌的能力等優點，酵母在基因工程的表達系統中日益受到重視。外源基因進入酵母菌一般采用遺傳轉化的方法，1978年Himmen等[1]和Beggs[2]分別報道了酵母菌原生質體轉化法，該方法轉化率較高，但需要脫去細胞壁進行轉化后再生，步驟比較繁瑣，不利于轉化子的快速制備。隨后Ito等[3]建立了完整酵母轉化法，該方法簡捷，但轉化率偏低。1985年，Karube等[4]和Hashimoto等[5]分別利用電擊法轉化酵母原生質體及完整細胞獲得成功后，電擊轉化法以其高轉化率、操作方便等優點越來越受到重視。現在，電轉化技術不斷提高，已被廣泛用于酵母細胞外源基因導入中[5～11]。本試驗以酵母EGY48為材料，研究了影響酵母電擊轉化的幾個因素，以期建立一套高效、簡便的酵母外源基因轉化系統，為進一步基因工程研究提供保障。

1材料與方法

1.1材料與試劑

酵母菌株：EGY48，為本實驗室保存；質粒：pLEXAD，為本實驗室保存。

YPD液體培養基：2%蛋白胨，1%酵母粉，2%葡萄糖；選擇培養基：SD/His-/Leu-培養基。各種培養用主要試劑和抗生素購自Promega公司；質粒提取試劑盒購自北京天根公司；其它化學藥品為國產分析純。

1.2試驗方法

1.2.1感受態酵母的制備挑取直徑為2～3mm的酵母單菌落于內有5mlYPD培養液的10ml搖管中，30℃、230～250r/min振蕩培養12～24h；取上述菌液0.5ml加入到內有500mlYPD培養液的1L三角瓶中，30℃、230～250r/min分別振蕩培養12、16、20、24、30h，測其OD600值；1500×g、4℃離心5min，棄上清，收集菌體；用500ml預冷的無菌水重懸；1500×g、4℃離心5min，棄上清，收集菌體；用250ml預冷的無菌水重懸；1500×g、4℃離心5min，棄上清，收集菌體；用20ml預冷的1mol/L山梨醇重懸；1500×g、4℃離心5min，棄上清，收集菌體；用1ml預冷的1mol/L山梨醇溶解，使終體積約為1.5ml；每管分裝80μl，備用。

1.2.2酵母電擊轉化取不同體積一定濃度的質粒DNA，使其終用量分別為1、2、5、10、15、20μg，分別加入80μl感受態細胞中，轉入0.2cm預冷的電擊杯中，冰上放置5min；采用伯樂電穿孔儀電擊，電壓分別設定600、800、1000、1200、1400V，電容25μF，電阻400Ω；后向電擊杯中立即加入1ml預冷的1mol/L山梨醇，轉入1.5ml無菌離心管中；取200～600μl涂平板，30℃倒置培養3～6d，直至出現菌落。

2結果與分析

2.1不同培養時間對酵母轉化率的影響

將酵母分別培養12、16、20、24、30h后進行轉化，此時電壓采用1000V，質粒DNA用量為2μg，其他條件均相同。統計結果（圖1）表明：不同培養時間對平均轉化率的影響較大，培養20h、OD600值約為1.4的酵母轉化效果比較理想，平均轉化率最高，可達3.62×105轉化子/μgDNA。

不同生長時期的酵母細胞對轉化率影響較大，本研究的結果顯示，處于對數生長中期的酵母細胞生長旺盛，該時期電擊轉化效果明顯高于穩定期的細胞，推測可能是由于處于對數生長中期的酵母細胞壁結構疏松，更利于進行電擊轉化。對于感受態酵母的制備，建議現制現用，從而保證較高的轉化率。一般認為，電擊轉化是通過觸發細胞膜使其電通透性增大，瞬間形成小孔，從而使各種生物大分子進出細胞[14，15]。電壓較低時，細胞不容易瞬間形成微孔通道，質粒DNA等生物大分子難以進入細胞，無法完成轉化；電壓過高，則會導致大部分細胞因小孔形成較大，難以復原而死亡，降低了酵母細胞的存活率，也影響了轉化率。本試驗條件下，電壓為1000V時，酵母轉化率最大。質粒DNA的用量對電擊轉化率也有一定的影響，原因可能是當質粒DNA濃度較低時，電擊產生的細胞小孔可以允許大部分的DNA分子進入細胞；但當質粒DNA用量增大，超過最大容納值時，細胞能吸收的DNA分子達到極限飽和狀態，反而降低了轉化率。

根據本試驗方法，培養時間為20h、OD600=1.4、電擊電壓為1000V、質粒用量為5μg時，該系統轉化效率最為理想，可以滿足電擊轉化試驗要求，為后續高效文庫的篩選奠定了基礎。

參考文獻：

[1]HinnenA，HicksJB，FinkJR.TransformationofYeast[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1978，75：1929-1933.

[2]BeggsJD.TransformationofYeastbyaReplicationHybridPlasmid[J].Nature，1978，275：104-109.endprint

[3]ItoH，FukudaY，MurataK，etal.TransformationofIntactYeastCellsTreatedwithAlkaliCations[J].J.Bacteriol.，1983，153（1）：163-168.

[4]KarubeI，TamiyaE，MatsuokaH.TransformationofSaccharomycecerevisiaespheroplastsbyhighelectricpulse[J].FEBSLetts.，1985，182：90-94.

[5]HashimotoH，MorijawaH，YamataY，etal.AnovelmethodfortransformationofintactyeastcellsbyelectroinjectionofplasmidDNA[J].AppliedMicrobiol.Biotechnol.，1985；2：336-339.

[6]徐志武，張穎，王智學，等.一種高效的釀酒酵母和畢赤酵母電擊轉化法[J].中山大學學報（自然科學版），2010，49（3）：98-

101.

[7]高炳淼，唐天樂，長孫東亭，等.畢赤酵母高效電轉化條件的研究[J].中國海洋藥物，2010，2：1-5.

[8]金筱耘，趙愛春，李軍，等.Monellin-EGFP融合蛋白在畢赤酵母中的表達[J].食品科學，2012，33（13）：171-175.

[9]郭春和，焦茂興，何俊，等.抗菌肽CecropinD基因在畢赤酵母中的表達與抗菌活性分析[J].中國預防獸醫學報，2011，33（11）：858-861.

[10]朱永梅，曹永生，李鑫，等.鵝干擾素-α的畢赤酵母表達及其生物學活性分析[J].中國獸醫科學，2013，43（4）：401-406.

[11]蘇嵐，曾令兵，周勇，等.草魚呼腸孤病毒VP6蛋白在畢赤酵母中表達的初步研究[J].淡水漁業，2012，42（6）：38-42.

[12]奧斯伯F，金斯頓RE，塞德曼JG，等著.精編分子生物學實驗指南[M].顏子穎，王海林譯，金冬雁校.北京：科學出版社，1998，23-24.

[13]方勤，田靜.電轉化法提高平連載體DNA轉化效率的研究[J].生物技術，1999，9（4）：5-8.

[14]MeihocE，MassonJM，TeissieJ.Highefficiencytransformationofintactyeastcelllsbyelectricfieldpulses[J].Biotechnol.，1990，8（3）：223-227.

[15]秦玉靜，金建玲，鮑曉明，等.影響釀酒酵母電擊轉化率的條件[J].山東大學學報（自然科學版），1999，2：236-240.endprint

[3]ItoH，FukudaY，MurataK，etal.TransformationofIntactYeastCellsTreatedwithAlkaliCations[J].J.Bacteriol.，1983，153（1）：163-168.

[4]KarubeI，TamiyaE，MatsuokaH.TransformationofSaccharomycecerevisiaespheroplastsbyhighelectricpulse[J].FEBSLetts.，1985，182：90-94.

[5]HashimotoH，MorijawaH，YamataY，etal.AnovelmethodfortransformationofintactyeastcellsbyelectroinjectionofplasmidDNA[J].AppliedMicrobiol.Biotechnol.，1985；2：336-339.

[6]徐志武，張穎，王智學，等.一種高效的釀酒酵母和畢赤酵母電擊轉化法[J].中山大學學報（自然科學版），2010，49（3）：98-

101.

[7]高炳淼，唐天樂，長孫東亭，等.畢赤酵母高效電轉化條件的研究[J].中國海洋藥物，2010，2：1-5.

[8]金筱耘，趙愛春，李軍，等.Monellin-EGFP融合蛋白在畢赤酵母中的表達[J].食品科學，2012，33（13）：171-175.

[9]郭春和，焦茂興，何俊，等.抗菌肽CecropinD基因在畢赤酵母中的表達與抗菌活性分析[J].中國預防獸醫學報，2011，33（11）：858-861.

[10]朱永梅，曹永生，李鑫，等.鵝干擾素-α的畢赤酵母表達及其生物學活性分析[J].中國獸醫科學，2013，43（4）：401-406.

[11]蘇嵐，曾令兵，周勇，等.草魚呼腸孤病毒VP6蛋白在畢赤酵母中表達的初步研究[J].淡水漁業，2012，42（6）：38-42.

[12]奧斯伯F，金斯頓RE，塞德曼JG，等著.精編分子生物學實驗指南[M].顏子穎，王海林譯，金冬雁校.北京：科學出版社，1998，23-24.

[13]方勤，田靜.電轉化法提高平連載體DNA轉化效率的研究[J].生物技術，1999，9（4）：5-8.

[14]MeihocE，MassonJM，TeissieJ.Highefficiencytransformationofintactyeastcelllsbyelectricfieldpulses[J].Biotechnol.，1990，8（3）：223-227.

[15]秦玉靜，金建玲，鮑曉明，等.影響釀酒酵母電擊轉化率的條件[J].山東大學學報（自然科學版），1999，2：236-240.endprint

[3]ItoH，FukudaY，MurataK，etal.TransformationofIntactYeastCellsTreatedwithAlkaliCations[J].J.Bacteriol.，1983，153（1）：163-168.

[4]KarubeI，TamiyaE，MatsuokaH.TransformationofSaccharomycecerevisiaespheroplastsbyhighelectricpulse[J].FEBSLetts.，1985，182：90-94.

[5]HashimotoH，MorijawaH，YamataY，etal.AnovelmethodfortransformationofintactyeastcellsbyelectroinjectionofplasmidDNA[J].AppliedMicrobiol.Biotechnol.，1985；2：336-339.

[6]徐志武，張穎，王智學，等.一種高效的釀酒酵母和畢赤酵母電擊轉化法[J].中山大學學報（自然科學版），2010，49（3）：98-

101.

[7]高炳淼，唐天樂，長孫東亭，等.畢赤酵母高效電轉化條件的研究[J].中國海洋藥物，2010，2：1-5.

[8]金筱耘，趙愛春，李軍，等.Monellin-EGFP融合蛋白在畢赤酵母中的表達[J].食品科學，2012，33（13）：171-175.

[9]郭春和，焦茂興，何俊，等.抗菌肽CecropinD基因在畢赤酵母中的表達與抗菌活性分析[J].中國預防獸醫學報，2011，33（11）：858-861.

[10]朱永梅，曹永生，李鑫，等.鵝干擾素-α的畢赤酵母表達及其生物學活性分析[J].中國獸醫科學，2013，43（4）：401-406.

[11]蘇嵐，曾令兵，周勇，等.草魚呼腸孤病毒VP6蛋白在畢赤酵母中表達的初步研究[J].淡水漁業，2012，42（6）：38-42.

[12]奧斯伯F，金斯頓RE，塞德曼JG，等著.精編分子生物學實驗指南[M].顏子穎，王海林譯，金冬雁校.北京：科學出版社，1998，23-24.

[13]方勤，田靜.電轉化法提高平連載體DNA轉化效率的研究[J].生物技術，1999，9（4）：5-8.

[14]MeihocE，MassonJM，TeissieJ.Highefficiencytransformationofintactyeastcelllsbyelectricfieldpulses[J].Biotechnol.，1990，8（3）：223-227.

[15]秦玉靜，金建玲，鮑曉明，等.影響釀酒酵母電擊轉化率的條件[J].山東大學學報（自然科學版），1999，2：236-240.endprint