鹽酸頭孢他美酯干混懸劑微生物限度檢查方法的建立

甘永琦，朱 斌（廣西食品藥品檢驗(yàn)所，南寧 530021）

鹽酸頭孢他美酯是第三代口服廣譜頭孢菌素類抗生素。其通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成過程中黏肽鏈的交叉連結(jié)，使細(xì)菌不能形成完整的細(xì)胞壁，從而發(fā)揮抗菌作用，且其活性不受細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶的影響。其對(duì)鏈球菌屬、肺炎鏈球菌等革蘭陽性菌及大腸埃希菌、流感嗜血桿菌、克雷伯菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、淋病奈瑟氏球菌等革蘭陰性菌都有很強(qiáng)的抗菌活性，尤其對(duì)第一、二代頭孢菌素敏感性低的沙雷菌屬、吲哚陽性變形桿菌、腸桿菌屬及檸檬酸菌屬的抗菌活性較為顯著，但其對(duì)假單胞菌、支原體、衣原體、腸球菌等耐藥性微生物無效[1-5]。自1992年上市以來，鹽酸頭孢他美酯得到了廣泛地應(yīng)用，目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的劑型有干混懸劑、膠囊和片劑3種。2010年版《中國(guó)藥典》（二部）規(guī)定干混懸劑需進(jìn)行微生物限度檢查。為此，筆者根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄ⅪJ“微生物限度檢查法”口服制劑的規(guī)定，對(duì)鹽酸頭孢他美酯干混懸劑的微生物限度檢查方法進(jìn)行研究和敏感菌株驗(yàn)證，并用建立的方法對(duì)該品種進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)和控制菌檢查，以分析其微生物污染狀況。

1 材料

1.1 儀器

WGP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海安亭科學(xué)儀器廠）；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；生物安全柜（新加坡ESCO公司）；MSL3768型高壓滅菌鍋（日本三洋公司）等。

1.2 藥品與試劑

鹽酸頭孢他美酯干混懸劑（浙江普洛康裕制藥有限公司，批號(hào)：130603、120104、120604、120601、130502、120802、130502、130403；浙江震元制藥有限公司，批號(hào)：20130103、20121102、20130102、20130102、20130103、20130501、20130503、20120409、20121002、20130502、20121003）；pH為7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京三藥科技開發(fā)公司，批號(hào)：120331）；氯化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10019318）。

1.3 菌種

大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、枯草芽胞桿 菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（B）98001]、黑 曲 霉[CMCC（F）98003]均由中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.4 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：110105）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào)：1202022）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：1204102）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)：130311）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL，批號(hào)：121127）等均購自北京三藥科技開發(fā)公司；4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG，批號(hào)：1304172）和靛基質(zhì)（批號(hào)：130305）均購自北京陸橋技術(shù)部有限責(zé)任公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法的建立及驗(yàn)證

2.1.1 菌液的制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽胞桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，33 ℃下培養(yǎng)18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，25 ℃下培養(yǎng)24～28 h。上述培養(yǎng)物以0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數(shù)為50～100 CFU的菌懸液（菌懸液制備后應(yīng)在2 h內(nèi)使用，保存在2～8 ℃的菌懸液可在24 h內(nèi)使用）。

2.1.2 供試液的制備 取本品10 g，加pH為7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，用勻漿儀以1 000 r/min勻漿30 s，混勻，靜置5～10 min，取上清液作為供試液。

2.1.3 回收率試驗(yàn)（1）試驗(yàn)組：取供試液1 ml，另分別取各試驗(yàn)菌50～100 CFU，分別注入同一平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置于規(guī)定溫度下，細(xì)菌培養(yǎng)3 d，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)5 d，分別平行制備2個(gè)平皿，平板計(jì)數(shù)。（2）菌液組：取試驗(yàn)菌50～100 CFU注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置于規(guī)定溫度下，細(xì)菌培養(yǎng)3 d，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)5 d，分別平行制備2個(gè)平皿，測(cè)定所加入的試驗(yàn)菌數(shù)。（3）供試品對(duì)照組：取供試液1 ml注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置于37 ℃培養(yǎng)24～48 h，測(cè)定供試品的本底菌數(shù)。

對(duì)照組各試驗(yàn)菌的回收菌應(yīng)不低于70%。回收率＝（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)－供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液組的平均菌落數(shù)×100%。

2.1.4 細(xì)菌計(jì)數(shù)方法預(yù)試驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6]，選取大腸埃希菌作為敏感菌株，分別采用常規(guī)法和薄膜過濾法（沖洗量為100 ml）對(duì)2個(gè)廠家各1批樣品進(jìn)行方法篩選，結(jié)果見表1。

表1 大腸埃希氏菌驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（CFU/平皿）Tab 1 Verification results ofEscherichia coli（CFU/plate）

由表1可見，采用常規(guī)法試驗(yàn)，2個(gè)廠家生產(chǎn)的鹽酸頭孢他美酯的大腸埃希菌回收率均未達(dá)到70%，不能有效消除鹽酸頭孢他美酯對(duì)細(xì)菌的抑制作用，因此采用常規(guī)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)不可行；而采用薄膜過濾法試驗(yàn)結(jié)果顯示，沖洗量為100 ml時(shí)，大腸埃希菌的回收率＞70%，符合要求，因此初步確定采用沖洗量為100 ml的薄膜過濾法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

2.1.5 計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證 分別對(duì)3批樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證，細(xì)菌采用薄膜過濾法，用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗100 ml，其他菌種采用常規(guī)法進(jìn)行加菌回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證試驗(yàn)回收率結(jié)果（%）Tab 2 Recovery results of count verification test

由表2可見，5種規(guī)定試驗(yàn)菌的回收率均＞70%，符合2010年版《中國(guó)藥典》（二部）的規(guī)定，方法成立。

2.2 控制菌檢查方法的建立與驗(yàn)證

2.2.1 菌液的制備 接種大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數(shù)為10～100 CFU的菌懸液（菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2 h內(nèi)使用，若保存在2～8 ℃可在24 h內(nèi)使用）。

2.2.2 控制菌檢查方法（1）培養(yǎng)基稀釋法：供試品對(duì)照組取“2.1.2”項(xiàng)下的供試液10 ml，陽性對(duì)照組取供試液10 ml及大腸埃希菌10～100 CFU，陰性對(duì)照組取10 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，均接種至500 ml的BL培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24 h。（2）薄膜過濾法：取上述培養(yǎng)基稀釋法中各組的試液加入濾膜中，用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗100 ml，取出膜接種至100 ml的BL培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24 h。

取上述培養(yǎng)物0.2 ml，接種至含5 ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)5、24 h時(shí)置紫外光燈（366 nm）下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，則為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，若液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，則為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。

2.2.3 檢查方法的驗(yàn)證 大腸埃希菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表3（表中“+”表示MUG陽性，“－”表示MUG陰性）。由表3可見，培養(yǎng)基稀釋法中，有1批樣品的陽性對(duì)照組結(jié)果呈陰性，表明該方法不能有效消除鹽酸頭孢他美酯對(duì)大腸埃希菌的抑制作用；而薄膜過濾法中，陰性對(duì)照及供試組的MUG和靛基質(zhì)均呈陰性，陽性對(duì)照中2批樣品的MUG和靛基質(zhì)均呈陽性，表明采用薄膜過濾法進(jìn)行大腸埃希菌檢查的方法成立。

表3 大腸埃希菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Verification results ofEscherichia coli test

上述結(jié)果顯示，鹽酸頭孢他美酯干混懸劑對(duì)細(xì)菌有一定抑制作用，采用薄膜過濾法，加入100 ml的沖洗液可以消除其抑制作用。這表明，采用薄膜過濾法可進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)及大腸埃希菌檢查，采用常規(guī)法可進(jìn)行霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)。

2.4 樣品檢查

根據(jù)微生物限度檢查法口服制劑規(guī)定，采用建立的微生物限度檢驗(yàn)方法對(duì)2013年國(guó)內(nèi)共19批鹽酸頭孢他美酯干混懸劑進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果均未檢出大腸埃希菌，部分樣品存在少量細(xì)菌污染，但未超出限度，且未檢出霉菌和酵母菌，合格率為100%。

3 討論

頭孢他美酯是通過口服吸收的有生物活性的頭孢他美的酯類前藥[7]，其進(jìn)入腸壁和肝臟中被酯酶水解成頭孢他美后發(fā)揮其抗菌活性[8]。頭孢他美酯干混懸劑不溶于水，而采用離心沉淀法對(duì)供試品進(jìn)行前處理則對(duì)樣品本身所含的微生物有一定影響[9]。因此，本研究采用靜置取上清液的方法制備供試液，以避免藥渣對(duì)薄膜過濾的干擾。在細(xì)菌計(jì)數(shù)和控制菌檢查試驗(yàn)中，本品顯示了對(duì)大腸埃希菌的抗菌活性。該藥物本身僅具有較弱的抗菌活性[10]，由于體外缺乏酯酶，在溶液中不能完全水解成頭孢他美，導(dǎo)致活性受限。因此，可通過薄膜過濾加入100 ml的沖洗液進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)和控制菌檢查。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同廠家的樣品對(duì)大腸埃希菌的體外抗菌活性存在差異，說明企業(yè)的生產(chǎn)工藝不同，導(dǎo)致產(chǎn)品在水溶液中的穩(wěn)定性也不同。本研究為國(guó)內(nèi)首個(gè)全面報(bào)道頭孢他美酯干混懸劑微生物限度檢查方法學(xué)的研究，并對(duì)國(guó)內(nèi)2個(gè)廠家生產(chǎn)的樣品進(jìn)行了檢驗(yàn)，建立了可行、有效、統(tǒng)一的方法，可為該品種微生物限度檢查方法的收載提供借鑒。

[1]張淑華，歐真蓉，陳蜀，等.國(guó)產(chǎn)頭孢他美酯、頭孢他美酯體內(nèi)外抗菌作用研究[J].中國(guó)抗生素雜志，2001，26（2）：144.

[2]傅穎君.鹽酸頭孢他美酯體外抗菌作用[J].江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，42（3）：30.

[3]阮鄒榮，袁虹，孫凌，王選錠.鹽酸頭孢他美酯的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2000，16（4）：301.

[4]周大偉，武海霞.鹽酸頭孢他美酯的藥理和臨床應(yīng)用[J].張家口醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，20（6）：46.

[5]余澤波，向小琴，王其南，等.國(guó)產(chǎn)頭孢他美酯片臨床觀察[J].重慶醫(yī)學(xué)，2000，29（5）：458.

[6]彭曉姍，唐映紅.鹽酸頭孢他美酯體內(nèi)和體外抗菌作用研究[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2014，4（1）：33.

[7]俞紹鑫，吳朝倩.鹽酸頭孢他美酯的藥理與臨床應(yīng)用[J].中國(guó)抗生素雜志，2001，26（2）：153.

[8]劉家健，劉敦茀，曾曉輝，等.國(guó)產(chǎn)鹽酸頭孢他美酯的制備[J].中國(guó)抗生素雜志，2001，26（2）：151.

[9]周劍，李霞.藥品微生物限度檢查法中幾種樣品前處理方法的可行性研究[J].中國(guó)藥房，2012，23（33）：3 136.

[10]高麗佳，楊俊卿，劉全，等.頭孢他美酯的體內(nèi)抗菌作用研究[J].兒科藥學(xué)雜志，2001，7（2）：7.