HPLC法測定崗梅中熊果酸和齊墩果酸的含量

肖彩虹，余以剛，羅苑苑，李 尚（.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣州 5064；.廣州市黃埔區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣州 50700；.廣東省工傷康復(fù)醫(yī)院，廣州 50440）

崗梅為冬青科植物梅葉冬青Ilex asprella的干燥根及莖的炮制加工品，收載于《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》，其性寒味苦，有清熱解毒、生津止渴等功效，臨床一般用于治療感冒發(fā)熱、肺熱咳嗽、咽喉腫痛等證[1-3]。崗梅是我國南方常用中草藥，也是不少涼茶的主要原材料[4]。崗梅主要含有三萜及其皂苷類化合物，如烏索酸、熊果酸、齊墩果酸、坡模酸等成分[5-6]。其中，熊果酸和齊墩果酸互為異構(gòu)體，均為五環(huán)三萜酸，兩者功效相似，均具有抗炎抗菌、保肝降酶、降血脂、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和抗癌等多種活性[7-8]。目前，關(guān)于崗梅中的熊果酸、齊墩果酸的含量測定尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法測定崗梅中熊果酸和齊墩果酸的含量，以為控制崗梅的藥材質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，配有2996型紫外檢測器（美國Waters公司）；xp26型百萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）。

1.2 試劑

熊果酸對照品（批號：110742-200516）、齊墩果酸對照品（批號：110709-201206，純度：94.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、冰醋酸為色譜純，水為純化水。

1.3 藥材

崗梅藥材購自廣州仁和堂藥業(yè)連鎖藥店及廣州市大參林連鎖藥店，經(jīng)廣東省工傷康復(fù)醫(yī)院李尚副主任藥師鑒定，均符合《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（第一冊）標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液的制備[9]

精密稱取熊果酸對照品10.02 mg、齊墩果酸對照品5.316 mg，置于同一10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品貯備液。精密吸取混合對照品貯備液2 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml中分別含熊果酸0.20 mg和齊墩果酸0.10 mg的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取藥材粉末約3 g，精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚適量，浸泡過夜，加熱回流8 h，提取液揮干乙醚，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Thermo-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸（83∶5∶12，V/V/V）；流速：0.7 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：10 μl。分別取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μl，注入HPLC儀，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。理論板數(shù)以熊果酸峰計(jì)應(yīng)不低于2 000，熊果酸峰和齊墩果酸峰分離度均＞1.5。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；1.齊墩果酸；2.熊果酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.test samples；1.oleanic acid；2.ursolic acid

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ml，分別置于5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成熊果酸質(zhì)量濃度為20.04、40.08、100.2、200.4、400.8 μg/ml，齊墩果酸質(zhì)量濃度為10.09、20.18、50.45、100.9、201.8 μg/ml的系列混合對照品溶液。精密吸取上述混合對照品溶液各10 μl，分別按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以對照品的進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得熊果酸回歸方程為y＝539 369x－55 109（r＝0.999 8，n＝5），齊墩果酸回歸方程為y＝545 603x－5 142（r＝0.999 6，n＝5）。結(jié)果表明，熊果酸、齊墩果酸的進(jìn)樣量分別在0.200 4～4.008、0.100 9～2.018μg范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對照品溶液10μl，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，熊果酸、齊墩果酸峰面積的RSD分別為1.18%、1.36%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，在室溫下于配制后1、2、4、8、12、24 h按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，熊果酸、齊墩果酸峰面積的RSD分別為1.05%、1.48%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一份樣品各適量，共6份，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，熊果酸、齊墩果酸含量的RSD分別為1.23%、1.85%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批樣品各1.5 g，共6份，分別精密加入0.5 ml混合對照品貯備液（含熊果酸和齊墩果酸0.501 0、0.252 2 mg），按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測定

精密稱取不同產(chǎn)地的崗梅各適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并采用外標(biāo)法計(jì)算樣品的含量，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Result of recovery tests（n＝6）

表2 樣品含量測定結(jié)果（%）Tab 2 Result of content determination of samples（%）

3 討論

3.1 提取方法的考察

筆者曾比較了超聲、加熱回流后水解、冷浸和索氏提取4種提取方法。結(jié)果表明，加熱回流后水解和索氏提取測得樣品的含量比其他2種方法高出許多，且加熱回流后水解和索氏提取的方法兩者之間結(jié)果差異較小；但采用加熱回流后水解測得的樣品雜質(zhì)峰太多、基線不平、操作煩瑣，因此最終采用索氏提取的方法。筆者還比較了甲醇、無水乙醇、乙醚、甲醇-鹽酸4種提取溶劑對測定結(jié)果的影響。結(jié)果，以乙醚的提取率最高，故選擇乙醚作為提取溶劑。

3.2 流動相的選擇

由于熊果酸與齊墩果酸為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)與性質(zhì)均極其相似，分離測定較為困難。本研究分別采用了甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸為流動相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果以甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸為流動相時(shí)的色譜峰峰形良好、分離效果最佳。在測定中，流速對分離度的影響也比較大：當(dāng)流速為1 ml/min時(shí)，熊果酸與齊墩果酸峰分離度只能達(dá)到1.0；而當(dāng)流速降低到0.7 ml/min時(shí)，分離度＞1.5，可達(dá)到基線分離。因此，最終選擇0.7 ml/min作為流速。

3.3 檢測波長的選擇

熊果酸甲醇溶液的最大吸收波長為207 nm，而齊墩果酸甲醇溶液的最大吸收波長為206 nm，二者混合液的最大吸收波長為207 nm。但在207 nm波長下用HPLC法進(jìn)行測定，熊果酸峰和齊墩果酸峰分離度較差；而在210 nm波長處，熊果酸和齊墩果酸分離度＞1.5，基線平穩(wěn)，可同時(shí)檢測兩者含量，并且具有較高的靈敏度。故最終選擇210 nm作為檢測波長。

3.4 其他

本研究結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的崗梅中熊果酸和齊墩果酸含量稍有不同。這可能是由于藥材生長環(huán)境、采收時(shí)間、生產(chǎn)年限等不同，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)差異；也有可能是本研究所選崗梅樣品為根、莖混用，根、莖中各成分所占比例不同也可能導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)差異，具體原因有待以后進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，該方法準(zhǔn)確、靈敏，可為崗梅的質(zhì)量控制提供參考。

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