蘄艾的HPLC指紋圖譜研究

盧 化，張義生，黎 強，楊小金，盧金清#（.武漢市中醫醫院藥劑科，武漢 43004；.湖北中醫藥大學/湖北省藥用植物研發中心，武漢 430065）

艾葉為菊科植物艾Artemisia argyi的干燥葉，具有散寒止痛、溫經止血的作用[1]。艾葉在全國各地均有分布，其中以湖北蘄春者品質最好，謂之蘄艾，譽為道地藥材。蘄艾Artemisia argyi Levl.et Van.var.argyi cv.Qiai為湖北省蘄春四寶之一，屬于我國國家地理標志產品，其莖、葉均可入藥?！侗静菥V目》中記載：“近代惟湯陽者謂之北艾，四明者謂之海艾，自成化以來，則以蘄州（蘄春舊稱）者為勝，用充方物，天下重之，謂之蘄艾。”現代研究表明，蘄艾具有抗炎、抗過敏、鎮痛、抗肝纖維化、抗疲勞、抗腫瘤、增強免疫、抗氧化等多種藥理活性[2-8]。有學者利用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時測定艾葉及其炮制品中棕矢車菊素和異澤蘭黃素的含量[9]。但蘄艾的藥效成分復雜，僅靠單一指標不能有效控制蘄艾質量。指紋圖譜對于中藥及其制劑可提供豐富的鑒別信息，能夠全面反映中藥多組分復雜體系，其宏觀、可量化的鑒別手段能綜合反映和有效控制中藥的質量，已成為國際公認的中藥質量評價和質量控制的有效手段。中藥指紋圖譜法從中藥材到中成藥的生產過程中，每一步都有明確的控制指標，而指紋圖譜就是將這些指標圖形化、信息化[10]。目前尚未有關于蘄艾指紋圖譜的相關研究。為了從整體上有效地評價和控制其質量，本試驗采用HPLC法對蘄艾指紋圖譜進行了初步的研究，以期為完善蘄艾的品質評價和質量控制提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

DIONEX-ULTIMATE 3000型HPLC儀（美國戴安公司）；CP225D型電子分析天平（德國賽多利斯公司，精度：0.01 mg）；UP5200H型超聲波清洗器（熊貓集團南京電子計量有限公司）。

1.2 試劑

柚皮苷、綠原酸、山柰酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：110722-201111、110753-201314、110861-00405）；乙腈為色譜純（美國天地公司），其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

10批蘄艾均于2011年5月采自湖北省蘄春縣，經湖北中醫藥大學生藥學教研室鑒定為菊科植物艾A.argyi的干燥葉。10批蘄艾藥材來源見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（梯度洗脫程序見表2）；流速：0.8 ml/min；柱溫：30 Ⅺ；檢測波長：330 nm。色譜見圖1。

表1 10批蘄艾藥材來源Tab 1 Origins of 10 batches ofA.argyi

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedures

圖1 高效液相色譜圖A.供試品；B.柚皮苷對照品；C.山柰酚對照品；D.綠原酸對照品；E.混合對照品溶液；F.陰性對照；1.綠原酸；2.柚皮苷；3.山柰酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.test sample ；B.naringin control；C.kaempferol control；D.chlorogenic acid control；E.mixed control；F.negative control；1.chlorogenic acid；2.naringin；3.kaempferol

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取柚皮苷、綠原酸、山柰酚對照品各適量，分別加甲醇溶解制成質量濃度為1.00、0.12、0.15 mg/ml的柚皮苷、綠原酸、山柰酚對照品溶液，即得。

2.2.2 混合對照品溶液 分別精密稱取柚皮苷、綠原酸、山柰酚對照品各適量，混勻，置同一量瓶中，加甲醇溶解制成質量濃度分別為1.29、0.05、0.09 mg/ml的柚皮苷、綠原酸、山柰酚的混合對照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液 取蘄艾藥材樣品約3 g，粉碎，精密稱定，精密加入80%甲醇溶液100 ml，靜置24 h，超聲萃取1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一批次蘄艾藥材樣品適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件下連續進樣5次，記錄色譜圖。結果，各共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值均＜2%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取同一批次蘄艾樣品適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于制備0、2、4、8、16、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，各共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值均＜2%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批次蘄艾樣品適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，各共有峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值均＜2%，表明本方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與分析

2.4.1 指紋圖譜的測定與特征峰的確定 分別精密吸取10批樣品溶液各2 μl，注入色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，共標定12個共有峰作為蘄艾藥材的指紋圖譜特征峰，并選擇6號峰（柚皮苷峰）作為參照峰。蘄艾的指紋圖譜見圖2；10批次蘄艾樣品的HPLC指紋圖譜見圖3。

圖2 蘄艾的指紋圖譜3.綠原酸；6.柚皮苷；10.山柰酚Fig 2 fingerprint ofA.argyi3.chlorogenic acid；6.naring in；10.kaemplferol

圖3 10批次蘄艾樣品的HPLC指紋圖譜Fig 3 HPLC fingerprint of 10 batches ofA.argyi samples

2.4.2 相似度評價 將所得的圖譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004版），經過色譜峰匹配，進行色譜峰差異性評價和整體相似性評價；通過該評價系統得出蘄艾的HPLC指紋圖譜共有模式，經過與共有模式比較，10批蘄艾共有峰的相對保留時間以及相對峰面積的差別均較小，詳見表3、表4。10批蘄艾藥材的相似度均＞0.90，表明所建立的指紋圖譜技術指標穩定、重復性好，10批蘄艾藥材的主成分基本相同，詳見表5。

表3 10批次蘄艾樣品指紋圖譜各共有峰的相對保留時間Tab 3 Relative retention time of 10 batches ofA.argyi samples fingerprint peaks

表4 10批次蘄艾樣品指紋圖譜各共有峰的相對峰面積Tab 4 Relative retention area of 10 batches ofA.argyi samples fingerprint peaks

表5 10批次蘄艾樣品相似度測定結果Tab 5 Similarity measurement results of 10 batches ofA.argyi samples

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

分別取柚皮苷、山柰酚、綠原酸對照品溶液及供試品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，采用二極管陣列檢測器（DAD）在190～400 nm波長范圍內進行掃描分析。結果顯示，在330 nm處對照品溶液與供試品溶液均有最大吸收，檢測靈敏度高，因此最終確定以330 nm為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

本試驗前期曾以甲醇-水、乙腈-水作為流動相進行等度和梯度洗脫考察，但色譜峰分離效果較差。在不斷嘗試色譜條件后，最終選用乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫，在該色譜條件下，色譜圖分離效果較為理想。

3.3 提取方法的選擇

本試驗分別采用加熱回流提取法、超聲提取法對蘄艾進行制樣。結果表明，加熱回流提取和超聲提取的結果差異不大，但超聲提取操作簡便、快捷，因此采用超聲提取法作為供試品溶液的制備方法。

本研究首次采用HPLC法對蘄艾的指紋圖譜進行了初步研究，試驗結果表明各批次樣品之間相似度較高，樣品之間相關性良好，符合中藥指紋圖譜相似度評價的基本要求。本研究初步建立了蘄艾的HPLC指紋圖譜，方法學考察結果表明該方法穩定、可靠、重復性好，可為蘄艾的品質評價和質量控制提供參考依據。

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