HPLC法測(cè)定陜西產(chǎn)黃花油點(diǎn)草中煙花苷的含量Δ

孫 靜，何曉娟，劉潔瓊（.陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 7046；.天津紅日藥業(yè)股份有限公司，天津

301700）

黃花油點(diǎn)草來(lái)源于百合科Liliaceae植物黃花油點(diǎn)草Tricyrtis maculate的干燥全草，具有安神除煩、活血消腫之功效，是陜西省民間用于跌打損傷的重要習(xí)用品種之一。該藥材在陜西蘊(yùn)藏量較高、用藥歷史悠久、療效突出，但目前尚缺乏相應(yīng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)。本課題組在前期基礎(chǔ)研究過(guò)程中，通過(guò)提取分離純化研究得到了該藥材的總黃酮部位，并發(fā)現(xiàn)該部位具有較強(qiáng)的活血作用，且煙花苷為其主要活性成分之一。本試驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)黃花油點(diǎn)草的水提取物和總黃酮部位中煙花苷的含量進(jìn)行測(cè)定，以期為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

L-2400型高效液相色譜（HPLC）儀（日本日立公司）；AR-1140型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度：0.1 mg）。

1.2 試藥

黃花油點(diǎn)草總黃酮部位[1-2]（實(shí)驗(yàn)室自制）；煙花苷對(duì)照品（BioBioPHa Co.，Ltd.，批號(hào)：BBP00732，純度：98.8%）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～30 min，15%→25%A；30～80 min，25%→55%A）；流速：1 ml/min；柱溫：20 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.煙花苷對(duì)照品；B.黃花油點(diǎn)草藥材；C.總黃酮提取物Fig 1 HPLC chromatogramsA.nicotiflorin control；B.T.maculate；C.total flavonoid extract

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取煙花苷對(duì)照品1.96 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.196 mg/ml的對(duì)照品貯備液。精密移取0.1 ml對(duì)照品貯備液，置于10 ml量瓶中，加甲醇定容，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得質(zhì)量濃度為1.960 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.2 總黃酮供試品溶液 精密稱取黃花油點(diǎn)草總黃酮[1]部位1 g，用甲醇定容至10 ml量瓶中，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.3 藥材供試品溶液 精密稱取同一批黃花油點(diǎn)草藥材5.200 3 g，按照提取工藝[2]提??；提取液濃縮干燥后，加甲醇溶液，濾過(guò)，并定容至50 ml量瓶中，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液3、6、9、12、15、18 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品的進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝4.7×103x+9 197.3（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，煙花苷的進(jìn)樣量在5.9～35.3 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取質(zhì)量濃度為1.9 μg/ml的煙花苷對(duì)照品溶液10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝0.49%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取總黃酮部位及藥材供試品溶液各適量，在室溫下放置0、2、4、6、9、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，藥材和有效部位中煙花苷峰面積的RSD分別為1.79%、1.98%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取總黃酮部位及黃花油點(diǎn)草藥材各適量，按“2.2.2”及“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，藥材中煙花苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.727%、0.733%、0.728%、0.739%、0.715%、0.720%，總黃酮部位中煙花苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.042%、1.036%、1.048%、1.015%、1.057%、1.023%，其RSD分別為1.19%，1.51%（n＝5），表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批藥材約5 g，共6份，分別精密加入質(zhì)量濃度為15 μg/ml的煙花苷對(duì)照品溶液1 ml，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.8 樣品含量測(cè)定

精密稱取總黃酮部位和藥材各適量，按“2.2.2”及“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取對(duì)照品溶液適量，在200～400 nm范圍進(jìn)行三維掃描，結(jié)果對(duì)照品溶液在360 nm下有最大吸收，且基線平穩(wěn)，故最終選擇360 nm波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3.2 液相儀器與色譜柱的選擇

選用Thermo Hypersil GOLD色譜柱分別在Waters2695-2966型和日立L-2400型HPLC儀上以甲醇-0.4%磷酸水（30∶70，V/V）為流動(dòng)相，對(duì)藥材供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定。根據(jù)出峰數(shù)與峰分離度情況選用儀器[3-5]，并對(duì)該儀器下的Thermo Hypersil GOLD、Thermo Hypersil GOLD aQ、Thermo BDS HYPERSIL C18等3種型號(hào)的色譜柱在同一條件下進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，日立雙泵及Thermo Hypersil GOLD分離效果優(yōu)于其他儀器及色譜柱，故選用此液相儀器及色譜柱進(jìn)行煙花苷含量測(cè)定的研究。

3.3 流動(dòng)相的選擇

分別以甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液系統(tǒng)在等度條件下測(cè)定煙花苷，根據(jù)出峰數(shù)目與峰分離度情況，初步確定選擇乙腈-磷酸水溶液系統(tǒng)為流動(dòng)相系統(tǒng)[6-9]；并在此基礎(chǔ)上對(duì)該系統(tǒng)的梯度洗脫條件進(jìn)行了進(jìn)一步研究，根據(jù)出峰個(gè)數(shù)、峰形及峰分離度進(jìn)行判斷，最終確定了“2.1”項(xiàng)下的流動(dòng)相系統(tǒng)，其色譜峰分離效果最好、出峰信息較多。

綜上所述，本方法穩(wěn)定、可行，可用于陜西產(chǎn)黃花油點(diǎn)草水提取物、總黃酮部位中煙花苷的含量測(cè)定。

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