RP-HPLC法測(cè)定含銀杏藥妝品中槲皮素的含量Δ

蔣 瑤，褚燕斌，孔 荔，張浩琳，王若晨，童 杰，馬 寧（長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 410219）

藥妝品（Cosmeceutical）是指具有藥物性質(zhì)的化妝品。由藥物（Pharmaceutical）和化妝品（Cosmetic）兩個(gè)詞組合而成，又稱功能化妝品（Function-cosmetics）、療效化妝品（Cos-medics）、醫(yī)學(xué)化妝品（Medicined cosmetics）、生理活性化妝品（Physiologically active cosmetics）或美容藥等，是集清潔、保養(yǎng)、美化、修飾于一體，具有抑制色素生長(zhǎng)、保持皮膚柔潤(rùn)嬌嫩、提升皮膚彈性等功效的化妝品。

含銀杏的藥妝品在國(guó)內(nèi)、外化妝品市場(chǎng)上占有較大份額，深受女士的喜愛(ài)。研究表明，槲皮素是銀杏提取物的重要有效成分之一，能潤(rùn)澤肌膚、抑制黑色素生長(zhǎng)、保持皮膚光澤與彈性、延緩皮膚衰老[1-5]。本研究首次采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定含銀杏藥妝品中槲皮素的含量，并對(duì)市售多種產(chǎn)品進(jìn)行了檢測(cè)，以為控制含銀杏藥妝品的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-600型HPLC儀，包括LC-P600型高壓恒流泵和LC-UV600型紫外檢測(cè)器（南京科捷分析儀器有限公司）；LC-100型液相色譜工作站（上海伍豐科學(xué)儀器有限公司）；AL204型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AS3120型超聲波清洗器（天津市奧特賽恩斯儀器有限公司）；溶劑過(guò)濾器（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限公司）；超純水機(jī)（上海和泰儀器有限公司）。

1.2 樣品與試劑

銀杏葉水漾精華（A，網(wǎng)購(gòu)，批號(hào)：P3x2）；銀杏柔潤(rùn)凝水柔膚液（B，網(wǎng)購(gòu)，批號(hào)：G08A45）；銀杏天然爽膚水（C，網(wǎng)購(gòu)，批號(hào)：VO304）；銀杏柔白水分精華液（D，網(wǎng)購(gòu)，批號(hào)：05A73YCB）；銀杏果嫩白精華液（E，網(wǎng)購(gòu)，批號(hào)：20140209）；槲皮素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100081-200907，純度＞98%）；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ODS-2HYPERSIL（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.5%磷酸（50∶50，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的槲皮素對(duì)照品1.0 mg，置于100 ml棕色量瓶中，加流動(dòng)相稀釋并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為10 μg/ml的對(duì)照品溶液，避光保存。

2.2.2 供試品溶液 取產(chǎn)品A約9 g，精密稱定，置于100 ml圓底燒瓶中，精密加入25 ml甲醇-25%鹽酸（4∶1，V/V）的混合溶液，搖勻使溶解，加熱回流2 h，放冷；轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相使溶解，定容至10 ml量瓶中；取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 取產(chǎn)品A約9 g，精密稱定，置于100 ml圓底燒瓶中，精密加入25 ml甲醇-水（4∶1，V/V）的混合溶液，搖勻使溶解，加熱回流2 h，放冷；轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，加甲醇定容，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相使溶解，定容至10 ml量瓶中；取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別吸取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰。結(jié)果顯示，槲皮素與供試品中其他組分的色譜峰可達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；所測(cè)成分理論板數(shù)以槲皮素峰計(jì)均不低于2 500；陰性樣品無(wú)干擾。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.槲皮素Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference；B.test samples；C.negative samples；1.quercetin

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取槲皮素對(duì)照品適量，用流動(dòng)相依次稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為0.565、1.130、1.695、2.260、2.825、3.390 μg/ml的對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣20 μl測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品的進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得槲皮素的回歸方程為y＝62 480x－622.64（r＝0.999 6）。結(jié)果表明，槲皮素的進(jìn)樣量在0.011 3～0.067 8 μg范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 檢測(cè)限與定量限

取質(zhì)量濃度為50 μg/ml的槲皮素對(duì)照品溶液適量，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。當(dāng)信噪比為3∶l時(shí)測(cè)得槲皮素的檢測(cè)限為0.058 μg/ml；當(dāng)信噪比為10∶l時(shí)測(cè)得槲皮素的定量限為0.149 μg/ml。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取質(zhì)量濃度為1.130 μg/ml的對(duì)照品溶液20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝1.73%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品A適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品A中槲皮素的含量。結(jié)果，樣品A中槲皮素的平均含量為1.715 2 μg/g，RSD＝1.36%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液適量，于室溫下放置，分別于配制0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝1.52%（n＝8），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品A共9份，每份約9 g，精密稱定，每3份為一組，分別精密加入高、中、低質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.10 樣品含量測(cè)定

分別精密稱取5種藥妝產(chǎn)品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并采用外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果，僅樣品A中槲皮素含量得以檢出，其含量為1.715 2 μg/g；其余產(chǎn)品不含槲皮素或槲皮素含量在檢測(cè)限以下。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相的選擇是HPLC法分離的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，根據(jù)有關(guān)槲皮素含量測(cè)定的相關(guān)文獻(xiàn)，筆者考察了甲醇-0.4%磷酸（50∶50，V/V）[6]、甲醇-0.4%磷酸（45∶55，V/V）[7]、甲醇-0.5%磷酸（50∶50，V/V）[8]3種流動(dòng)相體系對(duì)化妝品中槲皮素的洗脫效果。結(jié)果顯示，前兩個(gè)流動(dòng)相使待測(cè)成分發(fā)生了嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象；而甲醇-0.5%磷酸（50∶50，V/V）可有效改善其色譜行為，色譜峰形對(duì)稱、尖銳，且所有樣品在槲皮素出峰時(shí)間段內(nèi)無(wú)其他成分干擾。

3.2 提取方法的選擇

槲皮素為黃酮苷元，其水溶性較差，可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸等，而其苷類則較易溶于水[9]。本研究采用甲醇-25%鹽酸（4∶1，V/V）的混合液來(lái)提取并水解樣品中的槲皮素。該方法操作簡(jiǎn)單，同時(shí)所選取樣品中的其他成分對(duì)槲皮素的測(cè)定均無(wú)干擾作用。本研究曾考察過(guò)先水解后進(jìn)一步萃取的方法[10]，目的是為了減少供試品溶液中的雜質(zhì)，但用此法制備的樣品始終未能在槲皮素的相應(yīng)時(shí)間段內(nèi)出峰。

3.3 水解條件的選擇

銀杏藥妝品的產(chǎn)品成分中包含有銀杏葉提取物，而槲皮素是銀杏葉提取物中黃酮類化合物的主要成分之一[11]，因此在分析測(cè)定槲皮素含量時(shí)，一般先要通過(guò)在酸性條件下水解，使黃酮苷轉(zhuǎn)化成槲皮素等黃酮苷元。筆者曾考察甲醇-1.5 mol/L鹽酸（1∶1，V/V）[12]、甲醇-25%鹽酸（4∶1，V/V）[13]兩種溶液對(duì)樣品的水解效果。結(jié)果顯示，在水解時(shí)間相同的情況下，后者水解測(cè)得的槲皮素含量更高，因此最終確定采用甲醇-25%鹽酸（4∶1，V/V）的混合溶液對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行水解。又參考鄧丹丹等[14]的研究，最終確定樣品的水解時(shí)間為2 h。

3.4 方法適用性考察

試驗(yàn)所選的藥妝品均呈液體，產(chǎn)品的成分、性質(zhì)相似。對(duì)未檢測(cè)出槲皮素的樣品（即樣品B、C、D、E）進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，結(jié)果平均回收率分別為99.31%、101.28%、98.41%、99.49%。結(jié)果表明，該提取方法適用于測(cè)定所選的含銀杏藥妝品中槲皮素的含量。

3.5 陰性樣品的制備方法

銀杏葉提取物中的黃酮類化合物未經(jīng)酸水解一般不能得到槲皮素，因此在含量測(cè)定時(shí)，槲皮素在相應(yīng)時(shí)間段內(nèi)不會(huì)出峰。因此，本研究陰性樣品的制備為將“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備過(guò)程中的甲醇-25%鹽酸（4∶1，V/V）混合溶液改為甲醇-水（4∶1，V/V）混合溶液，其余試驗(yàn)條件不變，依法操作即得。

綜上，本研究選擇當(dāng)前市場(chǎng)上熱銷的5種知名藥妝品作為研究對(duì)象，建立了HPLC法以測(cè)定其中主要有效成分槲皮素的含量。結(jié)果表明，只有樣品A中可檢測(cè)出槲皮素，而其余4種藥妝品中均未檢出，說(shuō)明這些藥妝品中可能不含槲皮素或者槲皮素的含量低于檢測(cè)限。槲皮素作為銀杏藥妝品中的重要活性成分，若其含量未能得到有效控制，無(wú)疑損害了消費(fèi)者的利益，所以增加銀杏藥妝品中槲皮素含量的控制標(biāo)準(zhǔn)以保證其質(zhì)量，是非常必要的。因此，筆者呼吁相關(guān)部門有必要制訂藥妝品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步規(guī)范藥妝品市場(chǎng)，保護(hù)消費(fèi)者的權(quán)益。

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