雙波長HPLC法測定酸性龍膽合劑中龍膽苦苷和橙皮苷的含量Δ

王文月，劉志宏，黃愛文，宋洪濤#（.南京軍區福州總醫院藥學科，福州 350025；2.福建醫科大學藥學院，福州 35008）

酸性龍膽合劑臨床主要用于治療食欲不振及胃酸缺乏等癥。本品處方收載于《中國人民解放軍醫療機構制劑規范》（2002年版）中，在該標準的含量測定項中，僅有鹽酸的含量測定項，使得其制劑質量難以控制。有研究分別對龍膽苦苷或橙皮苷進行了單獨測定[1-4]，但單一指標成分測定難以反映中藥質量的整體特征。因此，本研究建立了雙波長高效液相色譜（HPLC）法同時測定龍膽苦苷、橙皮苷兩種成分含量的方法，以為進一步控制該制劑的質量水平提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀（美國Agilent公司）；SZ-97A型自動三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

酸性龍膽合劑（自制，批號：20131030、20131106、20131113、20131120、20131127、20131204）；稀鹽酸（鄭州天耀科技有限公司，批號：130419，分析純）；橙皮酊（福州海王金象中藥制藥有限公司，批號：121205）；龍膽苦苷和橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為：110770-201013、110721-201115，純度分別為：96.9%、95.3%）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，25%→30%A；10～20 min，30%→40%A；20～23 min，40%A）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：270 nm（龍膽苦苷）、283 nm（橙皮苷）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。在此色譜條件下，龍膽苦苷和橙皮苷的色譜峰形良好，保留時間分別為6.757、19.910 min，兩種組分的理論板數分別以龍膽苦苷峰和橙皮苷峰計均＞3 000，分離度均＞2.0。色譜見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密量取龍膽苦苷和橙皮苷對照品各適量，加甲醇制成每1 ml分別含龍膽苦苷和橙皮苷400、80 μg的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密量取本品2.5 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品（270 nm）；C.不含龍膽的陰性對照（270 nm）；D.供試品（283 nm）；E.不含陳皮陰性對照（283 nm）；1.龍膽苦苷；2.橙皮苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed substance control；B.test sample（270 nm）；C.negative control withoutR.Gentianae（270 nm）；D.test sample（283 nm）；E.negative control withoutC.reliculate（283 nm）；1.gentiopicroside；2.hesperidin

2.2.3 陰性對照溶液 按處方分別取各味藥材適量，按處方工藝分別制備不含龍膽和陳皮的陰性樣品，再按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法分別制備陰性對照溶液，即得。

2.3 線性關系考察

精密量取混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，經0.45微孔濾膜濾過，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（A）為縱坐標、對照品的質量濃度（c，μg/ml）為橫坐標，繪制標準曲線，得龍膽苦苷的回歸方程為A＝10.037 3c－65.697 6（r＝0.999 7）、橙皮苷的回歸方程為A＝9.132 7c－5.688 5（r＝0.999 7）。結果表明，龍膽苦苷和橙皮苷的質量濃度分別在20～200、4～40μg/ml范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.4 精密度試驗

精密量取混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件重復進樣測定6次，記錄峰面積。結果，龍膽苦苷和橙皮苷的峰面積RSD分別為0.54%、1.16%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗

精密稱取同一批號的樣品（批號：20131204）各適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定6次，記錄峰面積。結果，龍膽苦苷、橙皮苷的峰面積RSD分別為1.39%、1.32%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.6 穩定性試驗

精密稱取同一批樣品制備的供試品溶液適量，分別于放置0、1、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，龍膽苦苷、橙皮苷的峰面積RSD分別為1.89%、1.46%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品適量，共9份，分別精密加入一定量的龍膽苦苷和橙皮苷對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，混勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過。按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.8 樣品含量測定

精密稱取6批酸性龍膽合劑樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算各指標成分的質量濃度，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝6，mg/ml）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝6，mg/ml）

3 討論

3.1 測定指標的選擇

酸性龍膽合劑是由龍膽、陳皮和豆蔻3味中藥材加工制成的制劑。龍膽的主要成分包括裂環環烯醚萜及其苷類、生物堿、三萜類、黃酮類等化合物。其中，裂環環烯醚萜為龍膽的主要活性部位，包括龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和當藥苷等，龍膽苦苷為其指標性成分，故選其為含量測定指標[5]。陳皮主要含揮發油及橙皮苷為主的黃酮類成分等，故選擇橙皮苷為其含量測定指標[6]。豆蔻又稱白豆蔻，其中含有的大量揮發油是其重要的藥效成分，由于揮發油的含量測定采用的是氣相色譜法，故本研究未將其進行同時測定。

3.2 流動相的選擇

龍膽苦苷的含量測定方法收載于2010年版《中國藥典》（一部）中，以十八烷基硅烷鍵合膠柱為填充劑，以甲醇-水（25∶75，V/V）為流動相，檢測波長為270 nm[7]。《中國藥典》中橙皮苷的含量測定方法中流動相為甲醇-醋酸-水（35∶4∶61，V/V/V），檢測波長為283 nm[7]。因龍膽苦苷和橙皮苷的流動相皆為甲醇-水，并參考相關文獻[1-4]，試驗時以甲醇-水為流動相系統，并加入醋酸和磷酸作改性劑時，各峰峰形較好，分離度較高。

3.3 含量限度的確定

本研究結果表明，合劑中龍膽苦苷的質量濃度為0.330～0.339 mg/ml，橙皮苷質量濃度為0.069～0.076 mg/ml。2010年版《中國藥典》（一部）中龍膽藥材規定龍膽苦苷的質量分數不得低于3.0%，陳皮藥材規定橙皮苷的質量分數不得低于3.5%。按處方量折算，酸性龍膽合劑中龍膽苦苷質量濃度理論值為0.6 mg/ml，橙皮苷質量濃度理論值為0.63 mg/ml。考慮到藥材不同及滲濾工藝的提取率較低，根據6批樣品的質量濃度測定結果，取平均值的一半，規定合劑龍膽苦苷質量濃度每1 ml不得少于0.017 mg，橙皮苷質量濃度每1 ml不得少于0.036 mg。

綜上所述，本研究可為擬訂《中國人民解放軍醫療機構制劑規范》中酸性龍膽合劑的含量測定提供可靠依據。

[1]楊慧玲，司慶文，侯勤正，等.HPLC法測定不同海拔長柄秦艽中龍膽苦苷、馬錢酸、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷[J].中草藥，2010，41（10）：1 720.

[2]許秋霞，李小芳，舒予，等.干燥方法對龍膽炮制品中龍膽苦苷含量的影響[J].中國藥房，2013，24（7）：622.

[3]汪金玉，帥歐，林勵，等.橘葉黃酮類成分的研究與薄層色譜鑒別[J].廣州中醫藥大學學報，2011，28（2）：191.

[4]馬秋菊，孫萍.消脂通脈顆粒的質量標準研究[J].中國藥房，2013，24（35）：3 325.

[5]楊維霞.秦嶺龍膽的化學成分研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2004.

[6]王元清，嚴建業，師白梅，等.不同批次枳殼中柚皮苷、新橙皮苷、總黃酮、揮發油的含量比較及質量評價[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（7）：146.

[7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：89-176.