HPLC法測定余甘子不同提取部位中沒食子酸的含量

軒轅歡，魏 敏，田紅林，成 杰（.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 830004；.新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊 83000；3.武警新疆總隊醫(yī)院藥局，烏魯木齊 83009）

余甘子為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥成熟果實[1]，二級干、一級寒[2]，味甘、酸、澀[3]，具有清熱利咽、安神補(bǔ)心、潤肺止咳、收斂止瀉、開胃進(jìn)食等功效[4]，其中沒食子酸為其主要有效成分[5]。目前，對于余甘子不同制備部位分離純化的相關(guān)報道較少。為了加大余甘子藥材的資源利用程度，本試驗采用相關(guān)分離純化技術(shù)制備了余甘子不同提取部位，并分析各提取部位中沒食子酸的含量，以為余甘子的更深層次研究提供科學(xué)理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀，包括二級管陣列檢測器（美國Agilent 公司）；721s 型紫外分光光度計（上海精科儀器有限公司）；KQ5200B 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BS124S型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.2 試劑

沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：11672-201304，純度＞98%）；大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；C18硅膠（濟(jì)南博納生物技術(shù)有限公司）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

試驗所用藥材，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部田紅林副主任藥師鑒定為真品，具體來源見表1。

表1 余甘子來源Tab 1 Origin of P.emblica

2 方法與結(jié)果

2.1 余甘子不同提取部位的制備

取余甘子藥材適量，粉碎，精密稱取1 g，置于250 ml量瓶中，加70%甲醇150 ml，超聲（功率：70 W 頻率：40 kHz，下同）處理2 h，加70%甲醇定容，靜置2 h，濾過；濾液水浴60 ℃蒸干，加水溶解，用乙醚和乙酸乙酯先后萃取，萃取液過大孔樹脂層析柱進(jìn)行層析，以水～乙醇梯度洗脫，只留40%乙醇洗脫液和70%乙醇洗脫液（出膏率較高）；大孔樹脂40%、70%分流液水浴蒸干，加水溶解，過C18層析柱層析，分別得水、50%、70%甲醇洗脫液，60 ℃蒸干，依次得70%甲醇提取物、大孔樹脂40%乙醇洗脫液、大孔樹脂70%乙醇洗脫液、C18水洗脫液、C1850%甲醇洗脫液、C1870%甲醇洗脫液的干燥粉末，出膏率分別為70.5%、55.6%、50.2%、7.1%、11.7%、15.9%。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：ZORBAX Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸（10∶90，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果各成分理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于1.5，各成分基線分離良好，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.對照藥材；C.70%甲醇提取部位；D.大孔樹脂40%乙醇洗脫液；E.C18水洗脫液；F.大孔樹脂70%乙醇洗脫液；G.C1850%甲醇洗脫液；H.C1870%甲醇洗脫液；1.沒食子酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.reference crube herbs；C.methanol 70% extracts；D.macroporous resin 40% ethanol elutent；E.C18water elution；F.macroporous resin 70% ethanol eluent；G.C1850% methanol eluent；H.methanol C1870%eluent；1.gallic acid

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品適量，置于25 ml 量瓶中，加水溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為0.425 0 mg/ml的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取藥材粉末0.1 g，精密稱定，置于250 ml量瓶中，加水150 ml，放置過夜，超聲處理10 min，放冷，用水定容，搖勻，靜置，濾過；棄去初濾液50 ml，精密量取續(xù)濾液20 ml，置于100 ml棕色量瓶中，用水定容，搖勻，即得[1]。

2.2.4 不同提取部位供試品溶液的制備 分別精密稱取70%甲醇提取物、大孔樹脂40%乙醇洗脫液、大孔樹脂70%乙醇洗脫液、C18水洗脫液、C1850%甲醇洗脫液、C1870%甲醇洗脫液的干燥粉末（過2號篩）各10 mg，分別置于100 ml量瓶中，加水適量，放置過夜，超聲處理10 min，放涼后加水定容，即得。

2.2.5 線性范圍考察 精密量取“2.2.2”項下對照品溶液1、2、3、4、5 ml，分別置于10 ml量瓶中，加流動相定容，制成系列對照品溶液。精密吸取上述系列對照品溶液各10 μl，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以沒食子酸質(zhì)量濃度（x，mg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝20 210x+110.1（r＝0.999 9，n＝6）。結(jié)果表明，沒食子酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.042 5～0.212 5 mg/ml。

2.2.6 精密度試驗 取“2.2.2”項下對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸峰面積的RSD為1.1%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號：20140601）適量，分別于放置0、2、4、6、8 h時進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸峰面積的RSD為2.4%（n＝5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品（批號：20140601）適量，按“2.1”項下方法制備不同提取部位，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸峰面積的RSD 為1.5%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已含量的樣品（批號：20140601）適量，共6 份，按“2.1”項下方法制備不同提取部位，分別加入適量對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算樣品含量，并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test（n＝6）

2.2.10 樣品含量測定 取3 批樣品各適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算樣品含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 3 Results of contents determination of sample（n＝3）

3 討論

余甘子中富含大量水解類鞣質(zhì)、沒食子酸及酚酸類化合物，本試驗以用甲醇作為溶劑，所得沒食子酸含量較高，并篩選了20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%甲醇的提取效果，最終選擇70%甲醇為提取溶劑。

筆者首次采用大孔樹脂方法應(yīng)用于維吾爾藥材余甘子總鞣質(zhì)提取液的分離純化，洗脫時，采用水-乙醇梯度洗脫，分別選取不同質(zhì)量濃度乙醇（20%、40%、50%、60%、70%、80%、95%、100%）進(jìn)行了預(yù)試驗，測定出膏率，最終選擇了出膏率較高的40%乙醇和70%乙醇進(jìn)行沒食子酸的含量測定。采用C18層析柱層析洗脫時，采用了水、甲醇30%、50%、70%、90%、100%）進(jìn)行了洗脫，測定出膏率，選擇了出膏率較高的水、50%甲醇、70%甲醇進(jìn)行沒食子酸的含量測定。

綜上所述，該方法操作簡便、重復(fù)性好，可用于余甘子不同制備部位中沒食子酸含量的測定。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：311

[2]茹克婭·胡加阿不都拉，帕提古力·雅克甫，希爾艾力·吐爾遜，等.余甘子的維吾爾醫(yī)應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2011，17（12）：61.

[3]王飛，包永睿，孟憲生，等.不同產(chǎn)地余甘子酚酸類成分HPLC指紋圖譜研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，10（4）：31.

[4]《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編：下[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1978：335.

[5]王吉文，房志堅，成金樂，等.HPLC法同時測定鐵包金不同藥用部位中蘆丁和槲皮素的含量[J].中國藥房，2014，25（43）：4 098.