星點設計-效應面法優化重樓皂苷類成分的提取工藝Δ

鞠建峰，朱宗敏，杜忠科（山東中醫藥大學附屬醫院藥劑科，濟南 250014）

重樓為百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmithvar.yunnanensis或七葉一枝花Paris polyphylla var.chinensis的干燥根莖，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效，臨床主要用于疔瘡癰腫、咽喉腫痛、跌撲傷痛、驚風抽搐[1]。現代研究表明，重樓具有止血、抗腫瘤、抗菌、抗炎等作用[2-3]，其主要活性成分為甾體皂苷類成分[4]。

目前對重樓皂苷類成分的提取工藝主要是采用正交試驗設計法進行工藝參數優選，但正交試驗設計法試驗精度不夠，建立的數學模型預測性較差[5]。故本研究采用試驗精密度較高、預測值更接近真實值的星點設計-效應面法優選重樓總皂苷的提取工藝，以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ及重樓總皂苷的提取率為考察指標，在單因素試驗的基礎上，優化重樓皂苷的提取工藝參數，為重樓藥材的深入研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜（HPLC）儀（美國安捷倫公司）；TG-16型離心機（上海安亭科學儀器廠）；AB135-S型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；UV2600型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

重樓皂苷Ⅰ對照品（批號：111590-201103，純度：92.1%）、重樓皂苷Ⅱ對照品（批號：111591-201103，純度：93.4%），均購自中國食品藥品檢定研究院；重樓藥材（山東中醫藥大學附屬醫院，經山東中醫藥大學藥學院生藥系李峰教授鑒定為云南重樓Paris polyphyllaSmithvar.yunnanensis干燥根莖）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ和重樓總皂苷的含量測定

2.1.1 重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量測定[6-7]采用HPLC法。色譜條件：色譜柱為Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（48∶52），流速為1.0 ml/min；檢測波長為203 nm；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μl。經方法學考察，精密度、準確度、線性關系、專屬性和靈敏度均符合要求。

2.1.2 重樓總皂苷的含量測定[8]采用可見分光光度法。以重樓皂苷Ⅰ為對照品，高氯酸為顯色劑，水浴65 ℃加熱15 min，在408 nm波長下測定吸光度，用標準曲線法計算供試品中重樓總皂苷的含量。經方法學考察，精密度、準確度、線性關系均符合要求。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數的選擇 取重樓藥材6 份，每份50 g，稱定，分別加6 倍量（體積質量比，ml/g）的水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇回流提取60 min，提取1次，濾過，測定提取液中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ及重樓總皂苷的含量，并計算其提取率（提取率＝提取所得浸膏質量×浸膏中所測成分的含量/原藥材中所測成分的含量×100%），結果見表1。

表1 不同乙醇體積分數下重樓皂苷類成分的提取率（%）Tab 1 The extraction rate of saponins from P.polyphylla under the condition of different volume fractions of ethanol（%）

由表1可知，不同體積分數乙醇對重樓皂苷類成分提取影響較大，因此確定乙醇體積分數為20%～80%進行星點設計篩選。

2.2.2 提取時間的選擇 取重樓藥材6份，每份50 g，稱定，加6倍量60%乙醇，分別回流提取20、40、60、80、100、120 min，濾過，測定提取液中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ及重樓總皂苷的含量，并計算其提取率，結果見表2。

表2 不同提取時間下重樓皂苷類成分的提取率（%）Tab 2 The extraction rate of saponins from P.polyphylla under the condition of different extraction time（%）

由表2 可知，各提取時間對提取效果影響較大，故確定對所有提取時間范圍（20～120 min）進行星點設計篩選。

2.2.3 溶劑倍量的選擇 取重樓藥材6份，每份50 g，稱定，分別加4、6、8、10、12倍量的60%乙醇回流提取60 min，濾過，測定提取液中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ及重樓總皂苷的含量，并計算其提取率，結果見表3。

表3 不同溶劑倍量下重樓皂苷類成分的提取率（%）Tab 3 The extraction rate of saponins from P.polyphylla under the condition of different amount of solvent（%）

由表3 可知，各溶劑倍量均對提取效果有影響，確定選取4～12倍量進行星點設計篩選。

2.3 星點設計-效應面法優選重樓皂苷提取工藝

2.3.1 星點設計 為了更精確地考察最優因素水平值，選取乙醇體積分數（X1）、提取時間（X2）和溶劑倍量（X3）為自變量，以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ及重樓總皂苷的提取率作為評價指標。由于提取次數為非連續變量，回歸處理較困難，并從節約成本和工業生產的實際考慮，將提取次數定為2次。同時為了將所有指標綜合成一個能反映總體效應結果的值，試驗中以“總評歸一值”（Overall desirability，OD）來考察指標的綜合效果，根據文獻[9-10]的方法對各個指標進行歸一化處理。各指標由公式（1）計算di值：di＝（Yi－Ymin）/（Ymax－Ymin），其中Yi為實測值，Ymin和Ymax系指每一指標在不同次試驗中測得的所有值中的最小和最大值。計算出各指標的di值后，由公式（2）計算OD 值：OD＝（d1×d2……×dn）1/n，n為指標數。根據Central-Composite的中心組合試驗設計原理對各因素進行5 水平設計，用代碼值－α、－1、0、1、α來表示，見表4；試驗設計方案及結果見表5。

表4 Central-Composite試驗設計因素與水平Tab 4 Factors and levels of Central-Composite design

表5 Central-Composite 試驗設計與結果Tab 5 Arrangement and results of Central-Composite design

2.3.2 模型擬合及方差分析 將所得數據用Design-Expert 8.0軟件進行效應面試驗分析，以OD值分別對各因素X（自變量）進行多元線性回歸和二項式擬合。結果，多元線性回歸方程的相關系數（r＝0.654 2）較低，變量之間線性相關性較差，擬合度不佳，預測性較差。其中，二項式方程擬合回歸方程為OD＝0.42+0.23X1+0.12X2+0.035X3+0.055X1X2+0.031X1X3－0.021X2X3+9.8×10－3X12－0.093X22－0.036X32（r＝0.924 0），相關系數較高，擬合度較好，預測性較好。方差分析結果見表6。

表6 效應面擬合回歸方程的方差分析結果Tab 6 Results of variance analysis of the fitting regression equation with the response surface

由表6 可知，二項式回歸方程失擬檢驗不顯著，說明未知因素對試驗結果干擾較小；模型擬合檢驗顯著，說明方程與實際情況擬合良好，為成功模型；乙醇體積分數、提取時間對OD值的影響具有極顯著意義，所有交互項未達顯著性。

2.3.3 效應面優化與預測 應用Design-Expert 8.0 軟件進行三維效應面圖，詳見圖1。

圖1 各因素對OD 值的效應面圖Fig 1 Response surface of factors to OD value

由OD 值較高的水平確定最優提取條件：X1為80%，X2為100.91 min，X3為10.18 倍（ml/g），OD 最大預測值為0.986 0。根據擬合的二項式回歸方程，得出優化條件。鑒于試驗操作的可行性，確定最優工藝條件為加入80%乙醇10倍量（ml/g），回流提取2次，每次100 min。

2.3.4 驗證試驗 依據最優工藝條件，取重樓藥材3 份，每份50 g，進行驗證試驗，將測定的平均結果與擬合方程的預測值進行比較，并計算偏差率[偏差率＝（預測值－實測值）/預測值×100%]。結果，重樓皂苷Ⅰ提取率分別為85.4%、82.7%、87.1%；重樓皂苷Ⅱ提取率分別為85.9%、81.3%、83.6%；重樓總皂苷提取率分別為89.5%、92.1%、90.3%；OD 實測平均值0.964 9。預測重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ及重樓總皂苷提取率分別為86.2%、84.7%、90.9%，OD 預測值為0.986 0，偏差率為2.14%，說明二項式擬合效果良好，所建立的數學模型具有良好的預測性，所選工藝條件重現性較好。

3 討論

重樓藥材中含有多種皂苷成分，有重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等[3]。本研究選用含量較高的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ作為指標，采用HPLC 法進行含量測定，同時采用分光光度法測定總皂苷含量，評價指標全面，試驗結果可靠。

參考2010年版《中國藥典》重樓藥材項下重樓皂苷含量測定方法[1]，對重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ含量測定方法進行了考察，確定了其最優流動相比例：乙腈-水（48∶52）。在此條件下重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ峰形良好，達到基線分離，保留時間適中，檢測方便。

通過單因素試驗考察了提取時間、乙醇體積分數、溶劑倍量等因素的影響，為星點設計試驗奠定了基礎。結合生產實際和成本，將提取次數定為2 次，結果皂苷類成分基本提取完全。由于提取次數為非連續變量，因此未在星點設計-效應面法中對其進行優化。

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