冰片-葛根素脂質體的制備及其腦靶向性研究Δ

劉薇芝，胡漢昆，劉 萍，劉 巍，鄭 艷（武漢大學中南醫院藥學部，武漢 430071）

血腦屏障的特殊結構，使大多數治療腦部疾病的藥物難以進入腦組織。冰片為芳香開竅藥，研究表明，其能使血腦屏障生理性開放，增加血腦屏障通透性，促進藥物透過血腦屏障進入腦組織[1-3]。葛根素是從中藥葛根中提取的一種黃酮類化合物，葛根素注射液臨床應用廣泛，常用于治療腦血管疾病[4]。然而吳燕紅等[5]通過對葛根素注射液的藥動學和組織分布研究發現，葛根素注射液給藥后，主要分布在肝、腎、脾、肌肉、肺和生殖器官中，而在腦部分布較少。這使得藥物的治療作用不能充分發揮，增加了葛根素不良反應的發生幾率，限制了藥物的臨床應用。本研究擬制備冰片-葛根素脂質體，考察其能否促進藥物透過血腦屏障，增加腦部藥物濃度，從而為構建有效的腦部藥物遞送系統提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；TEM 100CXⅡ型透射電子顯微鏡（日本Jeol 公司）；Zetasizer3000HS 型激光粒度分析儀（英國Malvern 公司）；GS-15R 型高速冷凍離心機（美國Beckman公司）。

1.2 藥品與試劑

葛根素注射液（山東益健藥業有限公司，批號：20130806，規格：2 ml∶100 mg）；葛根素原料藥（康恩貝制藥股份公司，批號：20100608，純度：＞98%）；葛根素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110752-201109，供含量測定用）；冰片（上海邦成化工有限公司，批號：20121105，純度：93%）；大豆卵磷脂、膽固醇（國藥集團化學試劑有限公司）；Sephadex-G50 葡聚糖（美國Pharmacia 公司）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

昆明種小白鼠，SPF級，♂，體質量（20±2）g，購自武漢大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（鄂）2008-0004。本實驗經武漢大學中南醫院醫學倫理委員會批準。

2 方法與結果

2.1 脂質體的制備

采用薄膜分散超聲法，稱取處方量的卵磷脂500 mg、膽固醇100 mg、葛根素50 mg、冰片5 mg、維生素E 適量，加入無水乙醇溶解，在40 ℃恒溫水浴下減壓蒸發成薄膜，加入20 ml的pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（PBS）將薄膜洗脫分散，通氮氣條件下溫和水化2 h，于探頭超聲冰水浴下300 W 分散10 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾，整粒3 次制得冰片-葛根素脂質體，得混懸液。同法不加冰片制得葛根素脂質體。

2.2 脂質體表征考察

取“2.1”項下脂質體混懸液適量，將稀釋后的脂質體溶液點樣于銅網上，用2%的磷鎢酸負染，濾紙吸干染液后，用透射電子顯微鏡觀察并拍照，用激光粒度儀測定稀釋后脂質體的粒徑和Zeta 電位。結果顯示，所制備的冰片-葛根素脂質體輪廓清晰，呈圓形或類圓形，粒徑為226 nm，多分散指數（PDI）為0.263，Zeta 電位為－21.3 mV。冰片-葛根素脂質體的透射電鏡圖見圖1；粒徑分布圖見圖2。

圖1 冰片-葛根素脂質體的透射電鏡圖（×29 000）Fig 1 TEM of borneol-puerarin liposomes（×29 000）

圖2 冰片-葛根素脂質體的粒徑分布圖Fig 2 Particle size distribution of borneol-puerarin liposomes

2.3 包封率測定

2.3.1 色譜條件[6]色譜柱：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.5%磷酸水溶液（30∶70，V/V），流速：1 ml/min；檢測波長：250 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

2.3.2 葡聚糖凝膠過濾法測定包封率 精密移取冰片-葛根素脂質體0.5 ml，上預先處理好的Sephadex-G50 凝膠柱，用pH 7.0 的PBS 以1 ml/min 的流速在室溫下洗脫，合并所有鏡檢含脂質體的流分，以甲醇破膜并定容于25 ml，混勻，取10 μl進樣測定藥物濃度c1。另取0.5 ml 冰片-葛根素脂質體不過Sephadex-G50凝膠柱，以甲醇破膜并定容于25 ml，混勻，取10 μl進樣測定藥物濃度c2。按公式（包封率＝c1/c2×100%）計算所制備的3批脂質體的包封率，結果平均包封率為（65.32±2.13）%。

2.4 冰片-葛根素脂質體的腦組織分布研究

2.4.1 分組、給藥與取樣 取小鼠63只，禁食12 h，自由飲水，隨機分為3組，每組21只，分別按葛根素30 mg/kg（按人臨床常用劑量換算）單劑量尾iv 葛根素注射液、葛根素脂質體混懸液、冰片-葛根素脂質體混懸液。于給藥后5、10、15、30、60、90、120 min時脫臼處死小鼠，取腦組織，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱質量后在－20 ℃冷凍，待勻漿用。

2.4.2 樣品預處理 將腦組織用電動勻漿器制成1∶3（g/ml）的生理鹽水勻漿液，取1 ml 勻漿液于離心半徑5 cm（下同）、10 000 r/min 離心10 min。精密吸取上清液0.2 ml 置于1.5 ml離心管中，加入0.2 ml 6%的高氯酸水溶液沉淀蛋白質，渦旋混合2 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液，用0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液20 μl進樣測定。

2.4.3 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水溶液（30∶70，V/V），流速：1 ml/min；檢測波長：250 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。

2.4.4 方法專屬性 取葛根素對照品溶液、空白腦組織和給予冰片-葛根素脂質體混懸液后5 min的腦組織樣品，腦組織按“2.4.2”項下方法進行預處理，然后進樣測定，記錄色譜。結果表明，空白腦組織中內源性雜質對葛根素的測定無干擾，樣品中葛根素的保留時間約為11.53 min，可實現有效分離。色譜圖見圖3。

圖3 高效液相色譜圖A.葛根素對照品；B.空白腦組織樣品；C.腦組織樣品；1.葛根素Fig 3 HPLC chromatogramsA.puerarin control；B.blank brain tissue sample；C.brain tissue sample；1.puerarin

2.4.5 線性范圍考察 精密吸取小鼠腦組織勻漿液各200μl，加入葛根素對照品溶液，制備成質量濃度分別為0.045、0.225、0.45、0.90、1.80 μg/ml 的勻漿樣品，按“2.4.2”項下方法預處理后進樣測定。以葛根素的質量濃度（x）對峰面積（y）進行回歸分析，得回歸方程為y＝667.32x+50.12（r＝0.996 3）。結果，葛根素檢測質量濃度的線性范圍為0.045～1.80μg/ml，檢測限為0.032μg/ml（信噪比為3）。

2.4.6 回收率與精密度試驗 按“2.4.5”項下方法制備葛根素質量濃度為0.045、0.90、1.80μg/ml的腦組織勻漿樣品，每個濃度3個樣本，按“2.4.2”項下方法預處理后進樣測定；同時取相應質量濃度未經處理的葛根素對照品溶液分別進樣測定。以腦組織勻漿樣品和葛根素對照品溶液測得的峰面積之比計算提取回收率。腦組織勻漿樣品同日內測定6次，考察日內精密度；連續測定6 d，考察日間精密度。結果，低、中、高濃度腦組織勻漿樣品的提取回收率分別為（88.23±5.43）%、（91.25±3.76）%、（92.45±3.12）%，RSD 分別為6.15%、4.12%、2.88%（n＝3）；日內RSD 分別為5.75%、3.23%、1.81%（n＝6），日間RSD分別為6.65%、4.12%、2.31%（n＝6）。

2.4.7 穩定性試驗 取葛根素質量濃度為0.045、0.90、1.80μg/ml的腦組織勻漿樣品，分別考察室溫24 h、凍融3 次以及保存1個月的穩定性。結果，室溫24 h、凍融3 次以及保存1個月后測得樣品含量的RSD分別為2.74%、5.84%、3.88%（n＝3），表明上述條件下樣品穩定。

2.5 腦內分布考察

2.5.1 藥動學研究 根據各組小鼠腦組織勻漿中葛根素的含量，采用3p97藥動學軟件統計矩法處理實驗數據，計算藥動學參數。各組小鼠腦組織中葛根素含量的測定結果見圖4，藥動學參數見表1。

圖4 各組小鼠腦組織中葛根素質量濃度的測定結果（n＝3）Fig 4 Content determination results of puerarin in brain tissue of mice in each group（n＝3）

表1 3種樣品在小鼠腦組織中的藥動學參數（n＝3）Tab 1 The pharmacokinetic parameters of 3 kinds of samples in brain tissue of mice（n＝3）

從圖4 可知，給藥10 min 后葛根素注射液組腦中藥物達到最大質量濃度16.83μg/g，葛根素脂質體組和冰片-葛根素脂質體組給藥15 min 后達到最大質量濃度19.32 μg/g 和23.87μg/g。3種樣品中，冰片-葛根素脂質體組的cmax最高，與葛根素注射液組、葛根素脂質體組比較差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。從表1可知，冰片-葛根素脂質體組的AUC0-120min為1 487.89μg·min/g，是葛根素脂質體組的1.53 倍，是葛根素注射液組的2.58 倍。冰片-葛根素脂質體組的tmax均大于其他組，表明冰片-葛根素脂質體組中藥物透過血腦屏障進入腦組織的濃度最高、攝取量最大。

平均滯留時間（MRT）反映了藥物在體內的作用時間。本研究顯示，冰片-葛根素脂質體組MRT（82.81 min）＞葛根素脂質體組（66.09 min）＞葛根素注射液組（57.76 min），表明冰片-葛根素脂質體組中藥物在腦內的滯留時間最長，可更有效地延長藥物在體內的作用時間。從t1/2也可看出，冰片-葛根素脂質體組的代謝時間延長。綜上所述，與其他兩組比較，冰片-葛根素脂質體中葛根素在腦內的攝取量更大且作用時間更長。

2.5.2 腦靶向性初步研究 采用相對攝取率（Re）和峰濃度比（ce）對冰片-葛根素脂質體的腦靶向性進行初步研究。

Re＝（AUCi）C/（AUCi）S[2，7]，式中，AUCi是由濃度-時間曲線算得的第i個器官或組織的藥時曲線下面積，腳標C 和S 分別表示受試組和參比組。Re＞1表示與參比組比較，受試組藥物在該器官或組織有相應靶向性，Re愈大靶向效果愈好；Re＜1表示無靶向性。

ce＝（cp）C/（cp）S[2，8]，式中，cp為組織中藥物峰值，腳標C 和S分別表示受試組和參比組。ce值愈大，表明改變藥物分布的效果愈明顯。

根據表1 中藥動學參數，計算Re和ce值。結果，以葛根素注射液組為參比組，葛根素脂質體組和冰片-葛根素脂質體組的Re分別為1.68、2.58，ce分別為1.15、1.42，表明相比注射液，脂質體作為載體，具有一定的腦趨向性。與葛根素脂質體組比較，冰片-葛根素脂質體組的Re更大，這可能與冰片修飾脂質體后，冰片發揮了“芳香開竅、引藥上行”的功效，提高了血腦屏障通透性，從而進一步增加藥物的攝取量有關。這與吳紅兵等[3]研究結果類似。從ce結果可以看出，經過冰片修飾的脂質體在改善藥物的組織分布方面也更有優勢。

3 討論

本研究曾采用乙醇注入法、逆向蒸發法、薄膜分散法等多種方法制備脂質體，以脂質體的粒徑、包封率、載藥量等指標進行考察發現，采用乙醇注入法制備的脂質體粒徑偏大，而逆向蒸發法制備的脂質體包封率偏低。經過反復試驗，最終采用薄膜分散超聲法制備脂質體。

本研究表明，采用脂質體包裹葛根素，可提高藥物在腦組織中的cmax，提高藥物攝取率。而采用冰片修飾的脂質體，與普通脂質體比較，藥物攝取量增加，MRT 更長，可更有效地改善藥物的腦組織分布，更有利于藥效的發揮。脂質體中合用冰片后，影響藥物在腦部分布的作用機制是什么？與血腦屏障的生理性開放是否相關？本研究下一步將采用小鼠腦毛細血管內皮細胞為模型，進一步考察冰片脂質體對血腦屏障的促滲作用及開放機制。

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