丁苯酞對阿司匹林在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的影響

施兵奇，劉增娟，楊秀嶺，陳麗霞，梁振江（.石家莊市第三醫(yī)院藥劑科，石家莊 0500；.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 050000）

阿司匹林（乙酰水楊酸）是一種抗血小板藥物，其通過抑制血小板環(huán)氧化酶1，減少血栓烷A2合成，抑制血小板聚集，發(fā)揮抗血栓的作用[1-2]。目前阿司匹林已廣泛用于預(yù)防和治療血栓性疾病。丁苯酞是一種新型抗腦缺血藥物，可以通過抑制血小板聚集、保護(hù)線粒體功能等多個環(huán)節(jié)提供腦保護(hù)作用[3]。阿司匹林和丁苯酞在腦缺血患者中經(jīng)常聯(lián)合使用，但聯(lián)合使用是否存在相互作用尚未見報道。由于阿司匹林口服吸收后在血漿中易被酯酶水解為水楊酸，因此，常采用測定血中水楊酸濃度的方法研究阿司匹林的藥動學(xué)[4]。本試驗通過采用高效液相色譜（HPLC）法測定血漿中水楊酸的濃度，探討丁苯酞對阿司匹林藥動學(xué)的影響，為臨床合理聯(lián)合用藥提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HPLC系統(tǒng)，包括515泵、486紫外檢測器、Empower Application 工作站（美國Waters 公司）；CPA225D 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；GL-20G-Ⅱ型冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XW-80A型渦漩混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；低溫冷藏箱（日本Sanyo公司）。

1.2 藥品與試劑

水楊酸對照品（批號：100419-200301，純度：99.9%）、苯甲酸對照品（批號：100106-201104，純度：99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；丁苯酞膠囊（石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，批號：11110611，規(guī)格：每粒0.1 g）；阿司匹林腸溶片（拜耳有限公司，批號：BJ09814，規(guī)格：每片100 mg）；甲醇為色譜純，磷酸和高氯酸等均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.072%磷酸水溶液（55∶45，V/V），流速：1.0 ml/min；檢測波長：235 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20μl；內(nèi)標(biāo)：苯甲酸。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

2.2.1 水楊酸溶液 精密稱取水楊酸對照品50 mg，置于50 ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備成質(zhì)量濃度為1 mg/ml的水楊酸溶液，5 ℃下保存，備用。

2.2.2 苯甲酸溶液 精密稱取苯甲酸對照品10 mg，置于50 ml 棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備成質(zhì)量濃度為200 μg/ml的苯甲酸貯備液。取貯備液5 ml于25 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制備成質(zhì)量濃度為40 μg/ml的苯甲酸溶液，5 ℃避光保存，備用。

2.3 血漿樣品預(yù)處理

取血漿樣品200 μl 于離心管中，加內(nèi)標(biāo)（40 μg/ml 苯甲酸溶液）20 μl，混勻，加沉淀劑（6%高氯酸水溶液）160 μl，渦旋混合1 min，6 500×g離心5 min，取上清液進(jìn)樣測定。

2.4 專屬性考察

將水楊酸溶液和苯甲酸溶液直接進(jìn)樣；將空白血漿、空白血漿+水楊酸和給藥后20 min的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后進(jìn)樣測定，記錄色譜。結(jié)果顯示，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)并不干擾水楊酸的測定；水楊酸和內(nèi)標(biāo)苯甲酸分離完全、峰形良好，保留時間分別為10.2、8.3 min。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.水楊酸溶液；B.苯甲酸溶液；C.空白血漿+水楊酸+苯甲酸；D.血漿樣品；1.水楊酸；2.苯甲酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.salicylic acid solution；B.benzoic acid solution；C.blank plasma+salicylic acid+benzoic acid；D.plasma samples；1.salicylic acid；2.benzoic acid

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取水楊酸溶液適量于量瓶中，加甲醇定量稀釋制成5、10、20、40、100、200、400、600 μg/ml 的水楊酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。取大鼠空白血漿180 μl，加水楊酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各20 μl，制備成水楊酸質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、4、10、20、40、60 μg/ml的模擬血漿樣品，按照“2.3”項下方法處理后，進(jìn)樣測定。以水楊酸與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)、水楊酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝0.113x+0.015 6（r＝0.999 4，n＝8）。結(jié)果，水楊酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.5～60 μg/ml，定量限為0.25 μg/ml（信噪比為10），檢測限為0.08 μg/ml（信噪比為3）。

2.6 精密度試驗

取空白血漿按“2.5”項下方法制備成水楊酸質(zhì)量濃度分別為1、10、40 μg/ml 的模擬血漿樣品，照“2.3”項下方法處理后，進(jìn)樣測定。于同日內(nèi)處理并測定5 次，考察日內(nèi)精密度；同法每日測定1次，連續(xù)測定5 d，考察日間精密度，結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收率試驗結(jié)果（n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision tests（n＝5）

2.7 回收率試驗

取空白血漿按“2.5”項下方法制備成水楊酸質(zhì)量濃度分別為1、10、40 μg/ml的模擬血漿樣品，每一濃度5份，照“2.3”項下方法處理后，進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以與標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣測定的峰面積的比值計算提取回收率；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品質(zhì)量濃度與理論濃度的比值，計算方法回收率，結(jié)果見表1。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取空白血漿按“2.5”項下方法制備成水楊酸質(zhì)量濃度為10 μg/ml的模擬血漿樣品，根據(jù)實際工作需要，分別在室溫（放置4 h）、冷凍（－40 ℃保存5 d）、反復(fù)凍融（冷凍-融化循環(huán)3次）條件下保存后，照“2.3”項下方法處理后，進(jìn)樣測定，考察水楊酸血漿樣品穩(wěn)定性。結(jié)果，室溫放置條件下RSD為0.75%、－40 ℃低溫保存條件下RSD 為6.91%、反復(fù)凍融條件下RSD為1.18%（n＝5），表明血漿樣品穩(wěn)定性良好。

2.9 藥動學(xué)實驗

取大鼠20只，隨機(jī)均分為對照組（植物油0.4 ml/只+阿司匹林10 mg/kg）與實驗組（丁苯酞80 mg/kg+阿司匹林10 mg/kg），給藥劑量按人常規(guī)劑量的8 倍計算，每日ig 藥物1 次，連續(xù)給藥10 d。末次給藥前及給藥后10、20、40、60、120、240、360、480、600、720 min 眼眶靜脈叢取血0.2 ml，置于預(yù)先肝素化的離心管中，混勻，6 500×g離心2 min，分離血漿，－40 ℃冷凍保存，照“2.3”項下方法處理后，進(jìn)樣測定，計算血藥濃度。利用DAS 2.0 藥動學(xué)統(tǒng)計軟件處理，采用統(tǒng)計矩法計算藥動學(xué)參數(shù)。采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包對藥動學(xué)參數(shù)AUC0-∞、t1/2、V和cmax進(jìn)行兩個獨立樣本的t檢驗；AUC0-720min、tmax、CL/F不服從正態(tài)分布，則進(jìn)行非參數(shù)檢驗。水楊酸在大鼠體內(nèi)的藥-時曲線見圖2，藥動學(xué)參數(shù)見表2。

由表2 可知，與對照組比較，實驗組大鼠體內(nèi)水楊酸的AUC0-720min、AUC0-∞和t1/2分別降低了25.65%、29.46%、35.48%（P＜0.05），CL/F增加了40.00%（P＜0.05），tmax與cmax未見明顯變化。

3 討論

由于水楊酸和苯甲酸均為弱酸，易發(fā)生解離吸附在色譜柱上，故采用甲醇-0.072%磷酸水溶液（55∶45）作為流動相，防止發(fā)生解離。苯甲酸與水楊酸結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似，采用HPLC法同時測定大鼠血漿中苯甲酸與水楊酸的血藥濃度，兩藥出峰時間較近且分離良好，與內(nèi)源性雜質(zhì)分離較好，故最終確定苯甲酸作為本實驗的內(nèi)標(biāo)。

圖2 水楊酸在大鼠體內(nèi)的藥-時曲線Fig 2 Concentration-time curves of salicylic acid in rats in vivo

表2 兩組大鼠體內(nèi)阿司匹林的藥動學(xué)參數(shù)（，n＝10）Tab 2 Pharmacokinetic parameters of aspirin in rats in vivo of 2 groups（，n＝10）

表2 兩組大鼠體內(nèi)阿司匹林的藥動學(xué)參數(shù)（，n＝10）Tab 2 Pharmacokinetic parameters of aspirin in rats in vivo of 2 groups（，n＝10）

注：與對照組比較，＊P＜0.05Note：vs.control group，＊P＜0.05

本實驗采用沉淀蛋白的方法處理血樣，以6%高氯酸作蛋白沉淀劑，除去血漿蛋白經(jīng)離心后直接進(jìn)樣。與使用甲醇作沉淀劑相比，高氯酸使用量較小，使進(jìn)樣濃度增加，提高了監(jiān)測的靈敏度，同時避免了吹干濃縮等步驟。

阿司匹林口服吸收后迅速轉(zhuǎn)化為水楊酸鹽，水楊酸鹽主要通過肝臟代謝消除，代謝產(chǎn)物有水楊尿酸、水楊基酚葡萄苷酸、龍膽酸和龍膽尿酸[5]。有些藥物可影響水楊酸的藥動學(xué)，如雙嘧達(dá)莫、復(fù)方丹參滴丸可使血漿水楊酸鹽濃度增加，皮質(zhì)激素可以降低血漿中水楊酸鹽的濃度[4-5]。丁苯酞可加速硝苯地平及多索茶堿在大鼠體內(nèi)的代謝消除[6-7]，對肝藥酶細(xì)胞色素P450（CYP）3A 和CYP2C19 沒有影響[8-9]。本實驗結(jié)果顯示，丁苯酞和阿司匹林聯(lián)用，在多劑量給藥時，tmax及cmax均未明顯變化，說明丁苯酞對阿司匹林吸收無顯著影響。水楊酸在血液中可與血清白蛋白可逆性結(jié)合，結(jié)合率高達(dá)80%～90%[10]，丁苯酞蛋白結(jié)合率為61%～65%，但V沒有明顯變化（P＞0.05），說明丁苯酞對水楊酸的分布無顯著影響。水楊酸在體內(nèi)主要經(jīng)CYP2C9和Ⅱ相結(jié)合酶（葡萄糖醛酸結(jié)合酶和甘氨酸結(jié)合酶）進(jìn)行代謝，生成相應(yīng)代謝物后從尿液中排出體外。本研究結(jié)果表明，AUC0-720min、AUC0-∞、t1/2明顯減小（P＜0.05），CL/F明顯增加（P＜0.05），可能是丁苯酞誘導(dǎo)水楊酸的代謝酶，使其活性增加，加快了水楊酸代謝，從而使清除率增加、半衰期減小。其確切作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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