白芍醇提物及不同極性部位的體外抗氧化作用研究Δ

秦亞東，汪榮斌，周娟娟，楊 茜（.安徽中醫藥高等專科學校藥學系，安徽 蕪湖 24002；2.安徽中藥資源研究所，安徽蕪湖 247；.安徽蕪湖市中醫醫院制劑中心，安徽蕪湖 24000）

白芍（Paeonia radix alba）為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，具有養血調經、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽之功效[1]。現代藥理研究表明，白芍在免疫系統、消化系統、心血管系統均具有調節作用，并具鎮靜、解熱、抗疲勞、抗腫瘤、抗氧化等功效[2-3]。

自由基在體內大量堆積后通過發生過氧化反應進而引發多種嚴重疾病[4]。隨著對中藥多糖抗氧化作用的研究，發現許多中藥多糖具有清除自由基的作用。中藥多糖來源廣泛、毒性較低、安全性好，其抗氧化作用的發現，為體內發生過氧化反應而致的機體損傷等相關疾病的治療提供了新的途徑和方法。秦亞東等[5-6]對白芍多糖提取方式及含量進行了報道；徐曉燕等[7]比較了白芍各部位的還原能力及抗植物油脂氧化方面的作用；夏穎等[8]使用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）清除法、Fe3+-三吡啶三吖嗪（FAAP）法考察了白芍粗提物的抗氧化活性。但白芍醇提物（CREt）及不同極性部位的體外抗氧化作用的系統研究尚未見報道，故筆者選用DPPH·、超氧陰離子自由基（O2－·）、羥基自由基（·OH）這3種常見的體外抗氧化活性試驗模型，篩選白芍體外抗氧化活性有效部位，以期為白芍在抗氧化劑研發方面的研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

MS104S 型萬分之一電子天平[瑞士梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司]；Cary60 型紫外-可見分光光度計（美國Agilent公司）；FD8-10型冷凍干燥機（美國Gold-Sim公司）；3-18K型離心機（德國Sigma公司）。

1.2 藥品與試劑

DPPH·（美國Sigma 公司，批號：1898-66-4，純度：≥97.0%）；抗壞血酸（VC，上海國藥集團，批號：20120902，純度：≥99.7%）；水楊酸、鄰苯三酚（天津市科密歐化學試劑開發中心，批號：20130905、20131107，純度：≥99.5%、≥99.0%）；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl，上海研生生化試劑有限公司，批號：1183-55-1，純度：≥99.5%）；30%過氧化氫（南京奧佳化工有限公司）；水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

白芍購自安徽亳州中藥材市場（批號：201306），由安徽中藥資源研究所劉曉龍研究員鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根。

2 方法

2.1 CREt及各部位浸膏的制備

取白芍干燥根500 g，粉碎后過80目篩，以15倍量95%乙醇浸泡1 d，收集濾液，重復2次，合并濾液后減壓濃縮，低溫真空干燥即得CREt浸膏，得率為6.20%[得率（%）＝提取物干浸膏質量（g）/藥材質量（g）×100%，下同]。另分別取白芍干燥根500 g，粉碎成粗粉后經50%乙醇回流提取2 次，合并濾液，分別以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液經旋蒸后低溫干燥，即得石油醚部位（CRP部位）浸膏，得率為0.73%；乙酸乙酯部位（CRE部位）浸膏，得率為1.27%；正丁醇部位（CRB部位）浸膏，得率為1.85%；水部位（CRW部位）浸膏，得率為2.86%。

2.2 DPPH·及VC溶液的制備

精密稱取DPPH·5 mg、VC 10 mg 分別溶于10 ml 95%乙醇中，超聲處理5 min，充分振搖，分別制備成質量濃度為0.5 mg/ml 的DPPH·貯備液和1.00 mg/ml 的VC 貯備液，根據試驗情況再用95%乙醇將貯備液進行梯度稀釋。

2.3 DPPH·清除能力的測定[9-10]

精密稱量“2.1”項下制備的各部位浸膏12 mg，以95%乙醇為溶劑，分別制備成質量濃度為0.75、1.5、3、6、12 mg/ml 的樣品溶液。分別取0.2 ml 樣品溶液和2.8 ml 0.05 mg/ml 的DPPH·溶液于10 ml具塞試管中，搖勻，在避光條件下反應60 min 后，于517 nm 波長處測定吸光度（As）；同時測定2.8 ml DPPH·溶液與0.2 ml 蒸餾水混合液的吸光度（A0），2.8 ml DPPH·溶液與0.2 ml 95%乙醇混合液的吸光度（A1）。清除率（%）＝[1－（As－A1）/A0]×100%，并計算半數抑制濃度（IC50）。同時以VC（0.2 mg/ml）為陽性對照，每組試驗平行測定3次。

2.4 O2－·清除能力的測定[10]

精密稱量“2.1”項下制備的各浸膏6 mg，以95%乙醇為溶劑，分別制備成質量濃度為0.5、1、2、4、6 mg/ml 的樣品溶液。取上述樣品溶液1 ml，分別加入5 ml Tris-HCl 緩沖液（pH 7.8），搖勻，置于25 ℃水浴中反應20 min 后加入0.2 ml 1.25 mg/ml 的鄰苯三酚溶液，反應5 min，加入1 ml 0.3 mg/ml HCl終止反應，分別于325 nm 波長處測定吸光度（As）；以蒸餾水（未加樣品溶液）為空白對照，測定溶液吸光度（A0）。清除率（%）＝（A0－As）/A0×100%，并計算IC50。同時以VC（0.2 mg/ml）為陽性對照，每組試驗平行測定3次。

2.5 ·OH清除能力的測定[10]

精密稱量“2.1”項下制備的各浸膏6 mg，以95%乙醇為溶劑，制備成質量濃度分別為1.25、2.5、5、10、15 mg/ml 的樣品溶液。取各部位浸膏上述樣品溶液1 ml，分別加入1 ml 0.8 mg/ml 的硫酸亞鐵銨溶液、1 ml 1 mg/ml 的水楊酸溶液、2 ml 0.5%的過氧化氫溶液，并以95%乙醇補足體積至10 ml，置37 ℃水浴中反應20 min 后，于510 nm 波長處測定溶液吸光度。未加樣品溶液的反應體系吸光度為A0；因供試液具有顏色，故應扣除未加供試液的背景吸光度A；各樣品溶液在反應體系中測定的吸光度為As。清除率（%）＝[A0－（As－A）]/A0×100%，并計算IC50。同時以VC（0.2 mg/ml）為陽性對照，每組試驗平行測定3次。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 CREt及不同極性部位對DPPH·的清除作用

在相同質量濃度下，CREt和CRE部位清除DPPH·的作用較強，12 mg/ml 時最大清除率分別可達（97.55±0.25）%、（82.54±0.36）%；CRP、CRB、CRW 部位對DPPH·的清除率相對較低，均未超過40%；各部位最大清除率均不及VC（0.2 mg/ml）組，差異均有統計學意義（P＜0.01 或P＜0.05）。CRP、CRB、CRW部位對3種自由基的清除作用不及CREt和CRE部位，差異均有統計學意義（P＜0.01）。CREt 和CRE 部位對DPPH·的清除作用呈現一定的量效關系，IC50分別為1.629、2.481 mg/ml，結果見表1。

3.2 CREt及不同極性部位對O2－·的清除作用

相同質量濃度下，CREt和CRE部位對O2－·的清除作用較強，6 mg/ml 時最大清除率可達81.45%、77.74%；CRP 部位、CRB部位及CRW部位對DPPH·的清除率相對較低，均未超過45%；各部位最大清除率均不及VC（0.2 mg/ml）組，差異有統計學意義（P＜0.01）；CRP部位、CRB部位、CRW部位清除作用不及CREt 和CRE 部位，差異有統計學意義（P＜0.01）。CREt和CRE部位對O2－·的清除作用呈現一定的量效關系，IC50分別為1.789、1.918 mg/ml，結果見表2。

表1 CREt 及不同極性部位對DPPH·的清除試驗結果（，n＝3，%）Tab 1 The elimination results of CREt and different polar parts to DPPH·（，n＝3，%）

表1 CREt 及不同極性部位對DPPH·的清除試驗結果（，n＝3，%）Tab 1 The elimination results of CREt and different polar parts to DPPH·（，n＝3，%）

注：與VC 比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與CREt 比較，#P＜0.01；與CRE部位比較，ΔP＜0.01Note：vs.VC，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.CREt，#P＜0.01；vs.CRE part，ΔP＜0.01

表2 CREt 及不同極性部位對O2－·的清除試驗結果（，n＝3，%）Tab 2 The elimination results of CREt and different polar parts to O2－·（，n＝3，%）

表2 CREt 及不同極性部位對O2－·的清除試驗結果（，n＝3，%）Tab 2 The elimination results of CREt and different polar parts to O2－·（，n＝3，%）

注：與VC比較，＊P＜0.01；與CREt比較，#P＜0.01；與CRE部位比較，ΔP＜0.01Note：vs.VC，＊P＜0.01；vs.CREt，#P＜0.01；vs.CRE part，ΔP＜0.01

3.3 CREt及不同極性部位對·OH的清除作用

在相同質量濃度下，CREt、CRE 部位、CRB 部位清除·OH的作用較強，最大清除率可達75.28%、72.16%、62.53%；CRP部位、CRW部位對·OH的清除率相對較低，均未超過30%；各組最大清除作用均不及VC（0.2 mg/ml）組，差異有統計學意義（P＜0.01）。CRP 部位、CRB 部位及CRW 部位清除作用不及CREt、CRE部位，差異有統計學意義（P＜0.01）。CREt和CRE部位對·OH 的清除作用呈現一定的量效關系，CREt、CRE 及CRB部位IC50分別為5.268、6.005、7.232 mg/ml，結果見表3。

表3 CREt 及不同極性部位對·OH 的清除試驗結果（，n＝3，%）Tab 3 The elimination results of CREt and different polar parts to·OH（，n＝3，%）

表3 CREt 及不同極性部位對·OH 的清除試驗結果（，n＝3，%）Tab 3 The elimination results of CREt and different polar parts to·OH（，n＝3，%）

注：與VC比較，＊P＜0.01；與CREt比較，#P＜0.01；與CRE部位比較，ΔP＜0.01Note：vs.VC，＊P＜0.01；vs.CREt，#P＜0.01；vs.CRE part，ΔP＜0.01

3.4 陽性對照VC對3種自由基的清除作用

按照“2.3”“2.4”“2.5”項下方法分別測定不同質量濃度VC對DPPH·、·OH、O2－·的清除作用。結果顯示，VC質量濃度在0.02～0.2 mg/ml之間時，對3種自由基的清除作用隨著質量濃度的增加而增加，呈現濃度依賴性。其中當VC 質量濃度為0.1 mg/ml時，對DPPH·的清除率達92.31%；當VC質量濃度為0.08 mg/ml 時，對·OH、O2－·的清除率分別達到81.68%、82.05%。

4 討論

為了提高試驗結果的可比性，試驗中應注意以下幾點：第一，試驗過程中應嚴格保持試驗條件的一致性，包括試劑的配制應一次完成，測試不能分批進行等；第二，應排除樣品溶液本身顏色帶來的影響；第三，由于各組樣品溶解性不同，在制備高濃度樣品溶液時可采取超聲、靜置、濾過等方法促進各部位浸膏溶解。

試驗表明，CREt、CRE 部位對3 種自由基清除率較強，最大清除率均超過70%，其余部位較弱。CREt 組質量濃度為6 mg/ml 時，與0.1 mg/ml VC 對DPPH·的清除作用大致相當；CREt、CRE 部位質量濃度為6 mg/ml 時，與0.08 mg/ml VC 對O2－·清除作用大致相當；CREt、CRE部位、CRB部位對·OH最大清除率均未達到0.08 mg/ml VC 對·OH 的清除率（81.68%）。各試驗組的抗氧化作用均較VC弱，但各組間對3種自由基的清除作用又存在差異，且大致呈現濃度依賴。關于抗氧化作用不強的原因，可能是由于各試驗組中的抗氧化成分純度不高造成的。夏穎等[8]采用現代分離提取方法從白芍中提取出了單一化學成分五沒食子酰基葡萄糖（PCG），對DPPH·的清除作用就大于VC。PCG 為小分子化合物（CREt中的一個化合物），極性較大，可溶于極性較大的乙醇中，而CREt 在本研究中抗氧化活性也較高，因此夏穎等的結論一定程度上在本試驗中得到了驗證。盡管文中選取的3種經典體外抗氧化模型具有很大的代表性[10-12]，但仍不能代表白芍抗氧化的全部活性，且體外模型抗氧化作用不能真正代表體內抗氧化作用，體內、體外抗氧化作用之間的相關性也有待進一步研究。

使用不同極性溶劑提取中藥，獲得各部位提取物，然后通過所選指標進行藥效活性部位的篩選和排除，是中藥藥效物質基礎研究常用手段之一[11]。本研究初步排除了CRP、CRW部位，確定了CREt、CRE部位為抗氧化活性有效部位，在此基礎上筆者將進一步對活性部位進行研究。

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