N-乙酰半胱氨酸對(duì)兔肝缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用

戴大軍 蔡俊贏

1.江西省德安縣中醫(yī)院麻醉科，江西德安 330400；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，南昌 330000

肝缺血/再灌注損傷是肝臟外科手術(shù)中常見的病理過程，尤其是肝臟移植手術(shù)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肝功能衰竭[1]。肝缺血/再灌注損傷的病理機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果，如中性粒細(xì)胞和Kupffer 細(xì)胞被激活、細(xì)胞內(nèi)鈣超載[2]、氧自由基釋放[3]、一氧化氮和內(nèi)皮素水平失衡[4]、肝細(xì)胞凋亡等。本研究探討N-乙酰半胱氨酸（NAC）清除氧自由基的作用[5-6]與缺血/再灌注損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，揭示NAC 對(duì)肝缺血/再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（南京建成生物科技有限公司），總超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（南京建成生物科技有限公司），凱基原位末端標(biāo)記法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），TKR-200C 小動(dòng)物麻醉機(jī)（江西特力麻醉呼吸設(shè)備有限公司），全自動(dòng)生化分析儀（日本Olympus-AU2700），飛利普G30 多功能監(jiān)護(hù)儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選擇周齡3～4 周，體重3.5～4.5 kg 的健康實(shí)驗(yàn)兔40 只（南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供）。全部實(shí)驗(yàn)兔術(shù)前均禁食8 h，禁飲4 h。將其隨機(jī)分為兩組：肝缺血/再灌注組（I/R 組）和肝缺血/再灌注+N-乙酰半胱氨酸組（I/R+NAC 組）。I/R 組肝缺血30 min 后再灌注7 h；I/R+NAC 組于再灌注前5 min 泵注NAC 150 mg/kg，再灌注7 h 后持續(xù)泵注NAC 10 mg/（kg·h），I/R 組同時(shí)泵注等容量0.9%氯化鈉[7]。兩組實(shí)驗(yàn)兔在性別、周齡、體重、手術(shù)時(shí)間、出血量及輸液量等方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.3 模型制作

所有實(shí)驗(yàn)兔先肌注氯胺酮13 mg/kg 基礎(chǔ)麻醉，待麻醉成功后用飛利普G30 多功能監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)兔心電圖及血氧飽和度，并建立耳緣靜脈通路，隨后經(jīng)靜脈注射丙泊酚（2～4 mg/kg），維庫溴銨（0.1～0.3 mg/kg）后行氣管插管，接小動(dòng)物麻醉機(jī)控制呼吸（潮氣量=8 ml/kg，呼吸頻率=15 次/min），行右側(cè)股動(dòng)脈穿刺置管測(cè)直接動(dòng)脈壓。術(shù)中微量泵持續(xù)注入丙泊酚[1～3 mg/（kg·h）]，復(fù)合吸入異氟醚（1%～4%）維持麻醉。消毒鋪巾，采取上腹部正中切口，開腹后暴露肝門部，分離出門靜脈，用血管鉗夾閉以阻斷70%肝血流，30 min 后恢復(fù)血供[8]。

1.4 觀察指標(biāo)

兩組分別在門靜脈阻斷前（T0）、門靜脈開放即刻（T1）、開放后2 h（T2）、開放后5 h（T3）、開放后7 h（T4）5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)記錄心率（HR）、平均動(dòng)脈壓（MAP），經(jīng)股動(dòng)脈采血2 ml，檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、MDA、SOD 活性，其中ALT、AST 采用日本Olympus-AU2700 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，MDA 用硫代巴比妥酸化學(xué)比色法檢測(cè)，SOD 用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)[9-10]。并取肝中葉，用10%甲醛浸泡固定，石臘包埋后切片，檢測(cè)凋亡肝細(xì)胞數(shù)（原位缺口末端標(biāo)記法和瓊脂糖凝膠電泳法），在400倍光鏡下觀察每張切片，隨機(jī)計(jì)算5 個(gè)高倍鏡視野下的凋亡細(xì)胞數(shù)[11-13]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同時(shí)點(diǎn)HR、MAP 的比較

兩組實(shí)驗(yàn)兔T2、T3、T4時(shí)HR、MAP 均較T0、T1時(shí)明顯降低（P<0.05），但兩組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

表1 兩組不同時(shí)點(diǎn)HR、MAP 的比較（±s，n=40）

表1 兩組不同時(shí)點(diǎn)HR、MAP 的比較（±s，n=40）

與同組T0時(shí)比較，aP<0.05；與同組T1時(shí)比較，bP<0.05

2.2 兩組不同時(shí)點(diǎn)ALT、AST 的比較

與T0時(shí)比較，兩組T1、T2、T3、T4各時(shí)間點(diǎn)ALT、AST顯著升高（P<0.05）；與I/R 組比較，I/R+NAC 組T1、T2、T3、T4時(shí)ALT、AST 明顯下降（P<0.05）（表2）。

表2 兩組不同時(shí)點(diǎn)ALT、AST 的比較（U/L，±s，n=40）

表2 兩組不同時(shí)點(diǎn)ALT、AST 的比較（U/L，±s，n=40）

與同組T0時(shí)比較，aP<0.05；與I/R 組同時(shí)點(diǎn)比較，bP<0.05

2.3 兩組不同時(shí)點(diǎn)MDA、SOD 的比較

與T0時(shí)比較，兩組T1、T2、T3、T4各時(shí)間點(diǎn)MDA 明顯升高（P<0.05），SOD 明顯降低（P<0.05）；與I/R 組比較，I/R+NAC 組T1、T2、T3、T4時(shí)MDA 明 顯 下 降（P<0.05），SOD 明顯升高（P<0.05）（表3）。

表3 兩組不同時(shí)點(diǎn)MDA、SOD 的比較（±s，n=40）

表3 兩組不同時(shí)點(diǎn)MDA、SOD 的比較（±s，n=40）

與同組T0時(shí)比較，aP<0.05；與I/R 組同時(shí)點(diǎn)比較，bP<0.05

2.4 兩組不同時(shí)點(diǎn)肝細(xì)胞凋亡數(shù)的比較

原位缺口末端標(biāo)記法染色陽性表達(dá)在細(xì)胞核，呈深淺不一的棕黃色。T0、T1、T2時(shí)兩組間凋亡細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；I/R+NAC 組T3、T4時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)較I/R 組明顯降低（P<0.05）（表4）。

表4 兩組不同時(shí)點(diǎn)肝細(xì)胞凋亡數(shù)的比較（個(gè)/5HP，±s）

表4 兩組不同時(shí)點(diǎn)肝細(xì)胞凋亡數(shù)的比較（個(gè)/5HP，±s）

與I/R 組同時(shí)點(diǎn)比較，aP<0.05

3 討論

在肝臟大手術(shù)的并發(fā)癥中，肝缺血/再灌注損傷一直是研究的重要方向，尤其是肝臟移植手術(shù)術(shù)中都存在肝缺血，肝缺血/再灌注損傷可以導(dǎo)致肝功能障礙甚至衰竭。肝缺血/再灌注損傷的病理機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果，其中氧自由基的致傷機(jī)制在肝缺血/再灌注損傷中的作用已成共識(shí)[14]。中性粒細(xì)胞和Kupffer 細(xì)胞激活產(chǎn)生大量氧自由基，主要包括超氧化物自由基、氫氧根離子、過氧化氫等。氧自由基致傷機(jī)制主要有：氧化細(xì)胞膜磷脂雙分子結(jié)構(gòu)中的脂質(zhì)，改變細(xì)胞膜的通透性；損傷肝臟毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起粒細(xì)胞、血小板聚集，阻礙微循環(huán)；抑制線粒體氧化磷酸化，減少肝細(xì)胞的ATP合成，肝細(xì)胞供能障礙；氧化核酸酶使DNA 雙鏈斷裂；激發(fā)有關(guān)調(diào)控基因，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等，并使大量炎性因子活躍，炎癥反應(yīng)加劇，進(jìn)一步加重肝細(xì)胞缺血/再灌注后的損傷[15]。

血清ALT、AST 大量存在于肝細(xì)胞中，肝細(xì)胞損害時(shí)釋放入血，導(dǎo)致血中ALT、AST 明顯升高，對(duì)肝損害反應(yīng)靈敏，是目前臨床普遍應(yīng)用的指標(biāo)。SOD 是一種能通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化超氧化物為氧氣和過氧化氫的抗氧化酶，能夠在體內(nèi)清除超氧化物，保護(hù)組織細(xì)胞免受氧化損傷，發(fā)揮重要的氧化和抗氧化平衡作用[16]，測(cè)定SOD 活性是判斷缺血/再灌注損傷的間接指標(biāo)。MDA 是氧自由基作用于細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，能影響線粒體酶活性和呼吸鏈，MDA 是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)最重要的產(chǎn)物之一，也是最常用的細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化測(cè)定指標(biāo)[17]。細(xì)胞凋亡是再灌注早期肝臟細(xì)胞死亡的重要機(jī)制[18]，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)會(huì)激活一些DNA 內(nèi)切酶，內(nèi)切酶使基因組DNA 斷裂，暴露出來的3′-OH 經(jīng)過生物素標(biāo)記和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色后，在普通光學(xué)顯微鏡下可以觀察到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕黃色，而正常細(xì)胞則不染色。

NAC 是一種含巰基（-SH）的化合物，有直接抗氧化的作用是因?yàn)榭梢酝ㄟ^一個(gè)自由巰基與親電子的氧化基團(tuán)發(fā)生作用，NAC 分子中的活性巰基可對(duì)抗氧自由基導(dǎo)致的細(xì)胞氧化損傷[19-22]。NAC 對(duì)體內(nèi)氧自由基（O2-·、H2O2、·OH 等）具有顯著的清除作用。由于NAC 容易透過細(xì)胞膜，對(duì)能透過細(xì)胞膜的氧自由基（H2O2、·OH）具有拮抗和清除作用。張勇等[23]發(fā)現(xiàn)NAC 可以抑制大鼠肝臟缺血/再灌注引起的過氧化反應(yīng)和減少氧自由基的生成。

本研究結(jié)果顯示，I/R 組肝損害血清學(xué)指標(biāo)ALT、AST 在再灌注5 h 達(dá)到頂峰，脂質(zhì)過氧化指標(biāo)MDA也在再灌注5 h 達(dá)到最高，提示肝缺血/再灌注損傷以再灌注后5 h 最嚴(yán)重。兩組血清SOD 值于再灌注初期即開始降低，再灌注后5 h SOD 降到最低值，提示肝缺血/再灌注時(shí)有氧自由基的釋放和組織細(xì)胞的損傷，且I/R 組較I/R+NAC 組SOD 值下降更顯著，提示NAC 有一定氧自由基清除和拮抗作用。肝細(xì)胞切片用原位缺口末端標(biāo)記法和瓊脂糖凝膠電泳法觀察發(fā)現(xiàn)兩組都有肝細(xì)胞凋亡，但I(xiàn)/R 組在再灌注后5 h 凋亡明顯比I/R+NAC 組嚴(yán)重，這也提示NAC 對(duì)肝缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用。

綜上所述，氧自由基在肝缺血/再灌注損傷中起重要作用，NAC 通過抑制氧自由基釋放，清除氧自由基，抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減緩SOD 消耗，減少肝細(xì)胞凋亡，對(duì)肝缺血/再灌注損傷起保護(hù)作用。

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