Notch1在膽管癌細胞光動力療法中的作用研究

蘇　進，鄧小峰，熊　力，文　宇，苗雄鷹

(中南大學湘雅二醫院， 肝膽外科， 湖南 長沙 410011)

Notch1在膽管癌細胞光動力療法中的作用研究

蘇進，鄧小峰，熊力，文宇，苗雄鷹*

(中南大學湘雅二醫院， 肝膽外科， 湖南 長沙 410011)

摘要：目的：1、研究Photosan介導光動力療法(Photodynamic Therapy，PDT)對膽管癌細胞的殺傷作用。2、探討Notch1在膽管癌發生中的表達情況以及Notch1在PDT治療膽管癌細胞中的作用。方法：1、體外培養人膽管癌QBC939細胞株，在細胞對數生長期用不同濃度Photosan處理，并用半導體激光治療儀不同強度光照后，采用MTT法檢測PDT對QBC939細胞的殺傷作用。觀察不同的光敏劑孵育時間、光敏劑濃度及光照劑量對PDT效果的影響。2、采用免疫細胞化學方法和蛋白印跡法檢測膽管癌細胞Notch1表達，經Photosan介導光動力作用膽管癌細胞后，檢測膽管癌細胞內Notch1表達變化。結果：1、MTT結果顯示Photosan介導的PDT對膽管癌細胞有殺傷作用(P<0.05)，而且這種殺傷作用在一定范圍內隨著光敏劑濃度增加、光敏劑孵育時間、光照劑量呈正相關。2、免疫細胞學檢查發現Notch1在膽管癌細胞中高表達，其表達主要位于細胞膜及胞漿，并且經PDT處理后Notch1表達量較前減少(P<0.05)。結論： Notch1與膽管癌細胞生長、增殖密切相關，且Notch1在PDT對膽管癌細胞產生的抑制、促凋亡和殺傷作用中有重要作用。

關鍵詞：光動力療法；膽管癌；Notch1信號

流行病學調查發現，在世界范圍內膽管癌的發病率及死亡率均有上升趨勢，中國是膽管癌的發病大國, 約占全球膽管癌的55%[1, 2]。膽管癌的治療手段很多，手術切除仍為首選治療，但早期膽管癌缺乏明顯臨床癥狀，在診斷后使得超過50%患者失去手術切除機會，非切除膽管癌患者的生存期一般<1年[3]。光動力療法(photodynamic therapy， PDT)目前被認為是腫瘤姑息性治療手段之一，PDT具有高選擇性、操作簡單、可重復性、副作用少、治療效果佳等優點，不僅能夠提高不可切除膽管癌患者生存期，同時能改善患者的生活質量。PDT主要通過產生活性氧來誘導腫瘤凋亡，體外試驗及裸鼠膽管癌模型上均得到了證實，但具體的分子機制仍有待更深一步研究[4, 5]。最近越來越多的研究發現Notch信號通路在決定膽管癌生物學特性上有著重要意義，Notch信號過表達能促進膽管癌細胞增殖、遷移、上皮細胞間質化(EMT)、腫瘤血管形成及抗腫瘤藥免疫等，并與膽管癌的分化程度相關[6]。本研究旨在探討Notch信號在光動力治療膽管癌中的作用及 PDT的可能分子機制，為基于Notch信號通路的光動力治療提供依據。

1材料和方法

1.1材料

QBC939購自中南大學湘雅醫學院細胞中心，光敏劑Photosan購自德國(Seehof Labiratorium F&E GmbH Wesselburenerkoog)， MTT(Sigma-Aldrich公司，美國)，Hochest 33258(谷歌公司，武漢)，兔抗鼠Notch1多克隆抗體(Abcam公司，美國)，半導體激光光動力儀(深圳雷邁公司)，光纖(深圳雷邁公司)，超凈臺(蘇州凈化設備有限公司)，恒溫CO2細胞培養箱(Thermo公司，美國)，酶聯免疫檢測儀(Thermo公司，美國)，倒置顯微鏡(奧林巴斯，日本)，激光掃描共聚焦顯微鏡Leica TCS SP5(Leica/徠卡，德國)，熒光顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)。

1.2方法

1.2.1細胞培養及MTT試驗

膽管癌細胞株QBC939貼壁生長于DMEM完全培養液(含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L)，于37 ℃、5%CO2飽和濕度恒溫箱中培養，約48 h傳代一次，取對數生長期細胞，胰酶消化后離心制懸，計數板計數，濃度約為4×104/mL，接種于96孔板中，每組設4個平行孔，置于溫箱中孵育24 h后棄培養液，分別加入濃度為0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、8 mg/L、16 mg/L的Photosan，孵育時間分別設為0 h、1 h、2 h、4 h、8 h，光照前棄上清液，PBS清洗3次后加入含10%胎牛血清的完全培養液，調整半導體激光儀光照劑量分別為 0 J/cm2、5 J/cm2、10 J/cm2、15 J/cm2進行照射，波長為630 nm，溫箱中孵育24 h后進行MTT試驗，酶聯免疫檢測儀檢測吸光度(波長為570 nm)，測定各孔OD值，空白對照組進行調零，觀察PDT對QBC939的殺傷、抑制作用，并計算各組的細胞存活率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。以上試驗重復3次，全程在避光下進行。

1.2.2細胞免疫熒光測定Notch1在QBC939中的表達

取對數生長期的QBC939細胞種植于置有蓋玻片的6孔板中，溫箱中培養24 h后制成細胞爬片，4%多聚甲醛固定并用破膜工作液處理，依次加入兔抗鼠Notch1多克隆抗體(稀釋比1∶100)、山羊抗兔Hochest二抗，DAPI染核，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡拍照分析，激光共聚焦顯微鏡對Notch1表達分布進行亞定位，PBS代替一抗作為陰性對照。爬片成功后經PDT處理，同法進行細胞免疫熒光標記。結果判定標準：以細胞中出現紅色為陽性，其中細胞核染色且符合評分標準的定性為細胞核陽性。通過觀察各視野中細胞染色強度，以文獻中報道的陽性病例作為陽性對照。其中，根據熒光強弱分為：強陽性(+++)，陽性(++)，弱陽性(+)，表達陰性為(-)。

1.2.3Western-Blot測定PDT處理后QBC939中Notch1蛋白表達

于PDT處理后提取QBC939細胞中Notch1總蛋白，將其加入SDS聚丙烯凝膠電泳進行分離，然后轉入PVDF膜，用封閉液按1∶200的比例稀釋兔抗鼠Notch1多克隆抗體或抗β-actin抗體，膜與一抗孵育4 ℃過夜，封閉液按1∶500比例稀釋二抗，室溫搖床2 h，然后放入NBT/ BCIP中顯色，掃描，陽性條帶用Quantity One 4.4.1軟件分析。

1.3統計學分析

2結果

2.1PDT對QBC939細胞存活率的影響

PDT處理后通過光學顯微鏡觀察細胞形態學改變，QBC939細胞生長抑制明顯，細胞形態發生明顯皺縮，細胞核固縮，折光性下降，部分出現包膜皺縮、胞質濃縮、核固縮、染色質邊集、核裂解和凋亡小體形成，表現為壞死、凋亡改變。不同Photosan濃度、光敏劑孵育時間及光照劑量對QBC939存活率的影響見圖1-圖3，隨機選定其中兩個參數，得出另外一個參數的最佳值，最終當光照劑量為10 J/cm2、光敏劑濃度為8 mg/L、光敏劑孵育時間為4 h時，PDT對細胞的殺傷效果最佳(P<0.05)，抑制率達到72.72%，繼續增加光敏劑濃度、光照劑量及光敏劑孵育時間PDT所致細胞存活率的下降不明顯，差異無統計學意義。并且實驗過程中未見明顯光毒性及光敏劑毒性(P>0.05)。因此，Photosan介導PDT治療QBC939安全有效，且當Photosan濃度8 mg/L、光敏劑孵育時間4 h及光照劑量10 J/cm2時治療效果最佳。

圖1　選定光敏劑孵育時間為4 h、光照劑量為10 J/cm2時，不同光敏劑濃度對細胞存活率的影響Fig.1　The impacts of Photosan concentrations on cell viability of PDT, when light dose was 10 J/cm2 and incubate time was 4 h

圖2　選定光敏劑濃度為8 mg/L、光敏劑孵育時間為4 h時，不同光照劑量對細胞存活率的影響Fig.2　The impacts of light dose on cell viability of PDT, when Photosan concentration was 8 mg/L and incubate time was 4 h

圖3　選定光敏劑濃度為8 mg/L、光照劑量為10 J/cm2時，不同光敏劑孵育時間對細胞存活率的影響Fig.3　The impacts of incubation times on cell viability of PDT, when Photosan concentration was 8 mg/L and light dose was 10 J/cm2

圖4　激光共聚焦顯微鏡檢測Notch1的表達(×400)A：Notch1，主要表達于細胞膜和細胞質中；B：DAPI染核；C：A和B合并Fig.4　The expression of Notch1, detected by laser scanning confocal microscope(×400)A: Notch1, mainly expressed in cytomembrane and cytoplasm; B: Nucleus; C: A and B Merged

2.2免疫熒光檢測PDT對QBC939 Notch1表達的影響

圖5　Notch1在QBC939中呈強陽性表達(×200)A：Notch1蛋白；B：DAPI染核；C：A和B合并；D：PDT處理后Notch1蛋白表達，E：DAPI染核，F：D和E合并；G、H、I為陰性對照Fig.5　Notch1 was overexpressed in QBC939, detected by fluorescence microscope (×200)A:Notch1; B:Nucleus; C:A and B merged; D:The expression of Notch1 after PDT; E:Nucleus; F:D and E merged; G, H and I was negative control

免疫熒光檢測發現Notch1蛋白在 QBC939中強陽性表達(圖5)，在激光共聚焦顯微鏡下可以看出Notch1蛋白主要表達于細胞膜及細胞質中(圖4)。設定參數為光敏劑濃度16 mg/L、光照劑量為10 J/cm2時，經PDT處理后48 h行免疫熒光發現Notch1的熒光強度表達明顯降低，呈弱陽性(圖5)。

2.3Western Blot檢測PDT處理后Notch1蛋白的表達

Western blot檢測發現Notch1在QBC939細胞中均呈過表達狀態，設定參數為光敏劑濃度1 mg/L、光照劑量5 J/cm2、光敏劑孵育時間4 h，PDT處理后孵育48 h后行凝膠電泳，測量Notch1蛋白灰度值為19.51± 2.25，與對照組比較表現出下降(P<0.05)；當參數設定光敏劑濃度16 mg/L、光照劑量10 J/cm2、光敏劑孵育時間4 h時，PDT處理后，Notch1蛋白灰度值為14.55±2.01，與對照組比較有明顯差異(P<0.05)，A、B兩組之間差異也有統計學意義(P<0.05)(圖6)。

圖6　PDT處理后Notch1的表達變化.0組為對照組(未經PDT處理)A、B組經PDT處理(A組為低劑量光照、低濃度光敏劑組；B組為高劑量光照、高濃度光敏劑組)Fig.5　The expression of Notch1 after PDT, detected by Western-Blot. Group O was blank control. Group A and B deal with PDT(group A treated with 1 mg/L Photosan at light dose 5 J/cm2,while B treated with 16 mg/L Photosan at light dose 10 J/cm2)

3討論

光動力療法(PDT)應用于膽管癌的治療已有數十年，先后經歷了體外細胞實驗、動物模型實驗及臨床實驗三個階段，目前臨床上主要用于不可切除膽管癌的姑息性治療和術前新輔助治療[7-8]，也有個別報道稱應用膽道良性腫瘤和癌前病變的治療，如膽管乳頭狀瘤和重度非典型增生[9-10]。光動力療法在膽管癌細胞中的殺傷作用得到了國內外學者的證實，姜海濤[11]等使用血卟啉衍生物(HPD)介導光動力療法作用于膽管癌細胞，證實PDT在細胞實驗中有顯著的殺傷抑制作用，其抑制程度達到了80%。韓國學者Kim[12]等采用LED光源、光敏劑5-ALA對膽管癌細胞株HuCC-T1的殺傷作用研究，在無明顯光敏劑毒性的范圍內隨著光敏劑孵育時間延長，PDT效應越好。Wagner[13]等研究發現不同膽管癌細胞株對PDT的敏感性變化較大，并認為造成這種結果的原因在于miRs的作用。深入研究PDT在腫瘤作用的機制及相關影響因素將對提高腫瘤治療療效提供指導。

PDT所致的腫瘤細胞凋亡主要通過誘導細胞內外凋亡通路實現。大量體內外實驗證明[14-16]PDT通過上調caspase-3、caspase-7、caspase-9和caspase-12等凋亡蛋白的表達激活內外源性凋亡通路，最終誘導腫瘤細胞凋亡，其中以內源性占主導作用。最近有研究發現[6]Notch信號與膽管癌發生、發展、遷移和浸潤等特征有密切關系，一定程度上決定了腫瘤干細胞的狀態，在腫瘤的形成過程中發揮著原癌基因的特性。Zender等[17]發現Notch1信號胞內域(NICD)高表達誘導肝內膽管癌的形成，其下游靶基因HES-1在膽管癌多種細胞系中的高表達也得到證實。Notch1/2/3/4在肝外膽管癌中表達均有上調，其中Notch1的異常表達與肝外膽管癌的TNM分期相關，與腫瘤進展存在一定關系[18]。但也有學者發現[19-20]Notch1在腫瘤細胞中高表達伴隨著P53基因的異常表達，認為Notch1的過表達和 P53的失活在促進腫瘤發生發展有協同作用。由此可見，Notch信號在膽管癌的發生中有重要作用，并有可能協同多種因素促進腫瘤發生發展。

本次實驗中，我們首先通過MTT實驗來驗證PDT對膽管癌細胞的殺傷抑制作用。結果發現光動力療法對QBC939細胞抑制作用明顯(如圖1-3)，其抑制程度達72.72%，與完全空白對照組相比有明顯差異(P<0.05)，在一定范圍內，這種作用隨著PDT上述的三個參數強度的增加而增強，由此可以看出這三個參數在一定程度上能決定PDT的療效，為光動力的后續研究發展提供了基礎實踐依據。然而在實驗中我們發現，PDT并不能完全殺死膽管癌細胞，處理一段時間后QBC939得到重新生長，這也是PDT治療后腫瘤復發的原因，在動物模型及人體臨床應用中，腫瘤微環境變化更加微妙，而且受到光照滲透能力的限制，甚至光源導入途徑的困難處境，因此，除了本實驗中涉及的三個光動力參數以外，我們同時應當將目光定位于其他直接限制臨床應用及影響臨床療效的因素上，如光敏劑的改進、光源的革新，以及多種治療手段的聯合應用等。

然后驗證Notch1信號與PDT所致細胞凋亡的關系。通過免疫熒光我們發現Notch1蛋白在QBC939中明顯高表達，說明了Notch1可能與腫瘤的發生、發展存在一定關系。通過共聚焦顯微鏡對Notch1表達進行亞定位發現其主要表達位于細胞膜及細胞質中，這充分符合Notch受體胞內合成、胞膜上組裝并發揮生物學特征的特點。經過PDT處理后，Notch1的熒光強度較對照組明顯下調，呈弱陽性狀態，Western-blot檢測Notch1蛋白表達明顯降低(P<0.05)，QBC939增殖明顯受到抑制，并出現凋亡，說明了Notch1在膽管癌細胞中起促進增殖和抑制凋亡的作用。且PDT高參數組(B組)較低參數組(A組)相比，Notch1蛋白表達下降更加明顯(P<0.05)，說明了在一定范圍內PDT的療效與Notch1表達量負相關。由此可見，PDT可能通過引起QBC939細胞Notch1蛋白表達的減少來抑制細胞生長、誘導細胞凋亡甚至壞死，可能成為繼激活經典凋亡通路后光動力誘發細胞凋亡的新的機制。然而，Notch信號通路的其他成員在PDT治療中的作用如何仍需要更深入研究，光動力治療過程中Notch信號通路與凋亡通路之間的關系如何仍然有待探討和挖掘。因此，深入探索Notch信號通路與PDT的關系，在此基礎上全面開展基于Notch信號的光動力治療，可能成為腫瘤光動力治療的新方向。

4結論

綜上分析，體外實驗中PDT對膽管癌細胞有明顯的抑制和促凋亡作用，而這種作用可能和Notch信號通路表達異常有著密切關系。和細胞凋亡的兩大經典途徑不同的是，Notch通路較為簡單，而且可以通過和VEGF信號相互影響和調節腫瘤血管形成[21]，甚至是偶聯多種信號通路影響腫瘤的生物學特性，目前已經有部分靶向Notch信號通路的要藥物應用臨床研究中，證實了其臨床應用的實用性。因此，靶向Notch信號的光動力治療、PDT與靶向Notch信號的聯合治療或者指導腫瘤干細胞的治療等值得我們更進一步的研究和探索，為將來腫瘤的治療提供一種新的思路和方法。

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The Research of Notch1 in Photodynamic Therapy of Cholangiocarcinoma Cells

SUJin，DENGXiaofeng，XIONGLi，WENYu，MIAOXiongying*

(Department of Hepatobiliary Surgery, The 2nd Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410011, Hunan, China)

Abstract：Objective：1.Research the killing effect of Photosan mediated photodynamic therapy(PDT) for cholangiocarcinoma cells. 2.Investigate the expression of Notch1 protein in cholangiocarcinoma cells and the function of Notch1 when deal with PDT. Methods：1.Cholangiocarcinoma cells line QBC939 was cultured in vitro, and incubated with different concentration of Photosan when QBC939 growth is in the logarithmic phase, then irradiated with semi-conducted laser device with different light doses. Detect the killing effects of PDT for cholangiocarcinoma with MTT assay when applying with different incubation time and changable concentrations of photosensitizer and variable doses of light. 2.Detect the expression of Notch1 protein in cholangiocarcinoma cells by using immunofluoresence method and Western-blot method, and detect the variation of Notch1 after PDT. Result:1.MTT assay show that Photosan mediated PDT have killing effect to cholangiocarcinoma cells(P<0.05). Under certain circumstance, this result positively correlate to the longer incubation time, higher photosensitizer concentration and larger dose of light. 2.Notch1 was highly expressed in membrane and cytoplasm in cholangiocarcinoma which was detected by immunochemistry assay. The rate of Notch1 was decreassed when deal using different parameters for PDT. Conclusions：Notch1 protein was highly related to the development and proliferation of cholangiocarcinoma cells and plays important role in killing and hampering the growth of cholangiocarcinoma cells while treating with PDT.

Key words：photodynamic therapy; cholangiocarcinoma; Notch1 signal

文章編號：1007-7146(2015)06-0513-05

文獻標志碼：A

中圖分類號：R735.8

*通訊作者：苗雄鷹，中南大學湘雅二醫院普外科教授，博士生導師。(電子郵箱)4896142@qq.com

作者簡介：蘇進，中南大學湘雅二醫院碩士研究生，研究方向為肝膽腫瘤。(手機)15874182107；(電子郵箱)915769309@qq.com

基金項目：國家自然科學基金項目(81372628;81402536);長沙市科技局科技計劃(K1205018-31)；湖南省自然科學基金(12JJ5048);湖南省科技計劃(2012FJ3129；2013WK3029)；湖南省科技廳項目(2014WK2016)；美捷登青年科學研究基金(MJR20140011)

收稿日期：2015-09-10;修回日期:2015-10-10

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.06.004