基于高效液相色譜的一種測定雞蛋中三聚氰胺殘留的方法

蔡良英，趙 陽，丁春燕，陶 蕓

（湖州市德清縣食品藥品檢驗所，浙江湖州 313200）

基于高效液相色譜的一種測定雞蛋中三聚氰胺殘留的方法

蔡良英，趙 陽，丁春燕，陶 蕓

（湖州市德清縣食品藥品檢驗所，浙江湖州 313200）

針對雞蛋中的三聚氰胺，建立一套基于高效液相色譜的快速測定方法。以50%甲醇－1%三氯乙酸為提取溶液，經超聲、離心、正己烷除脂后，陽離子固相萃取柱凈化，采用庚烷磺酸鈉離子對試劑∶乙腈（85∶15，V∶V）為流動相，C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），外標法定量。該方法在0.5～80μg·mL－1線性良好，相關系數為0.999 8，加標回收率94.58%～97.62%，定量限為0.3mg·kg－1。

三聚氰胺；高效液相色譜；雞蛋

三聚氰胺是一種重要的化工原料，屬于非蛋白質含氮化合物，含氮量高達66.67%，常被違規加入食品中以提升蛋白質含量指標。近年來發生的一系列含三聚氰胺有毒食品事件嚴重損害我國居民的身體健康，引發了社會各界的廣泛關注。目前，食品中三聚氰胺的測定方法主要有液相色譜法［1－2］、氣相色譜串聯質譜法［3］、高效液相串聯質譜法［4－5］、毛細管電泳法［6－7］、離子色譜法［8］、酶聯免疫吸附法［9］、表面等離子體共振（SPR）技術［10－11］、近紅外光譜法［12］以及表面增強拉曼光譜法［13－14］，其中，高效液相色譜法操作相對簡單、運行成本低、是目前最為常用的檢測方法。由于樣本基質的差異性，針對飼料、乳制品中三聚氰胺建立起來的測定方法并不適用于雞蛋的測定。本文擬在現有國家檢測標準基礎上，簡化樣品前處理過程、優化色譜條件，建立針對雞蛋中三聚氰胺的高效液相色譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

美國Agilent 1260型高效液相色譜儀（帶二極管陣列檢測器）；C18色譜柱（Agilent，5μm，4.6 mm×250 mm）；PCX固相萃取小柱（美國Agilent公司）。甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），三氯乙酸（分析純），庚烷磺酸鈉（色譜純），三聚氰胺標準品（≥99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.2 標準溶液配制

準確稱取三聚氰胺標準品100 mg于100 m L容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg·mL－1的標準儲備液，于4℃避光保存。臨用前用50%甲醇水稀釋標準儲備液得到標準系列進行測定。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

取雞蛋打碎后用勻質器勻質1min，稱取5 g（精確至0.01 g）于25 mL具塞比色管，加入15 mL 1%三氯乙酸、5mL 50%甲醇，超聲提取20min后加1%三氯乙酸定容，6 000 r·min－1離心10min。取上清液加入三氯乙酸飽和的正己烷除脂，8 000 r·min－1 4℃離心10min，取上清液5mL待凈化。

1.3.2 凈化

依次用3 mL甲醇、3 mL 1%三氯乙酸活化固相萃取小柱。將待凈化液轉移至固相萃取柱中，依次用3 mL 1%三氯乙酸、3 mL甲醇洗滌。抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液分2次洗脫。洗脫液于50℃用氮氣吹至近干，殘留物用流動相定容，旋渦混合1 min，移取上清液過0.45μm微孔濾膜后，待測。

1.4 色譜條件

色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為庚烷磺酸鈉離子對試劑緩沖溶液／乙腈混合液（85∶15，V／V）；流速1.0 mL·min－1；柱溫40℃；檢測波長240 nm；進樣量20μL。以保留時間定性，外標法定量。

2 結果與討論

2.1 樣品處理條件選擇

三聚氰胺具有弱堿性，可溶于甲醇和乙腈，而三氯乙酸能使其轉化成鹽。考慮到乙腈的毒性和沉淀蛋白條件，本文選用50%甲醇和1%三氯乙酸為提取液。1%三氯乙酸能夠給三聚氰胺提供酸性環境，使其很好地溶解在上清液中，減少目標檢測物的損失。考慮到雞蛋與牛奶樣品的差異，在提取液中特別加入甲醇沉淀蛋白，同時增加正己烷去脂步驟，以達到較好的凈化效果。

另有文獻［15－16］報道，提取液不經過小柱凈化而直接進樣測定，雖然節約了檢測成本，但長時間、大批量的檢測樣品會對儀器，尤其是色譜柱造成不良影響。小柱洗脫過程中存在離子交換，為使洗脫液與萃取柱填充物充分接觸，洗脫速度不宜過快。試驗表明，洗脫流速小于1.5 mL·min－1時，回收率較理想。

2.2 方法評價指標

2.2.1 測定方法的線性范圍和檢出限

配制一系列濃度的三聚氰胺標準溶液，按色譜峰面積對三聚氰胺進樣濃度進行線性回歸，其線性范圍為0.5～80μg·m L－1，線性方程為A＝85.655C＋3.149，相關系數為0.999 8。三聚氰胺標準圖譜見圖1。按信噪比（S／N）為10計算，本方法定量限為0.3mg·kg－1。目前，我國國家標準中對食品中三聚氰胺的安全限值設定為2.5 mg· kg－1，可知本方法可以滿足檢測的要求。

圖1 三聚氰胺標準圖譜

2.2.2 加標回收率和精密度

準確稱取雞蛋樣品5.00 g，分別進行0.40，1.00，2.00，4.00 mg·kg－1 4個水平的加標回收和精密度試驗，每個添加濃度做6個平行。回收率精密度結果見表1。結果表明，在0.40～4.00 mg· kg－1的添加水平上，樣品的回收率為94.58%～97.62%，相對標準偏差為0.77%～3.09%，符合測定要求。添加1.00 mg·kg－1三聚氰胺標準品的雞蛋樣品以及空白雞蛋樣品的液相色譜圖見圖2。

表1 精密度試驗及加標回收率試驗結果（n＝6）

圖2 三聚氰胺加標樣品（a）與空白樣品（b）液相色譜圖

3 小結

本文建立起一套基于高效液相色譜的快速檢測雞蛋中三聚氰胺的方法，該方法前處理過程簡單，測試結果穩定且精確度較高，可滿足實際檢測要求。

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（責任編輯：高 峻）

O 657.7；TS 253.7

A

0528?9017（2015）11?1772?02

文獻著錄格式：蔡良英，趙陽，丁春燕，等.基于高效液相色譜的一種測定雞蛋中三聚氰胺殘留的方法［J］.浙江農業科學，2015，56（11）：1772－1773，1776.

DOI 10.16178／j.issn.0528?9017.20151121

2015?09?06

蔡良英（1988－），女，浙江湖州人，碩士，主要從事食品藥品檢驗與分析工作。E?mail：liangying_cai＠126.com。