不同溶劑的食用菌提取液對煙草病原菌的抑制作用*

鐘永麗，高現(xiàn)亮，羅華元，王 娜，董石飛，王偉丹，饒 智，王麗萍，蘭建強,**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，云南 昆明 650201；2.紅云紅河煙草（集團）有限責任公司,云南 昆明 650231；3.云南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，云南 昆明 650201）

不同溶劑的食用菌提取液對煙草病原菌的抑制作用*

鐘永麗1，高現(xiàn)亮1，羅華元2，王 娜3，董石飛2，王偉丹1，饒 智2，王麗萍3，蘭建強1,3**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，云南 昆明 650201；2.紅云紅河煙草（集團）有限責任公司,云南 昆明 650231；3.云南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，云南 昆明 650201）

采用濾紙圓片法和試管二倍稀釋法研究了食用菌的不同溶劑提取液對煙草3種致病菌異絲腐霉、黑脛病菌、青枯病菌的抑菌作用。結(jié)果表明，乙醇、丙酮、乙醚、三氯甲烷4種溶劑提取10種食用菌得到的提取液，對煙草異絲腐霉菌和黑脛病菌的菌絲生長均未表現(xiàn)出明顯的抑制效果，而對煙草青枯病菌的抑制作用有明顯差異。4種溶劑提取液對受試菌的抑菌濃度（MIC）范圍在0.03 mg·mL-1～7.63 mg·mL-1之間；抑菌能力大小順序為三氯甲烷提取液＞乙醇提取液＞乙醚提取液≥丙酮提取液。

食用菌；溶劑；病原菌；抑制

食用菌是一類可供食用、子實體碩大的高等真菌。中國已知的食用菌350多種，大多屬于擔子菌亞門，常見的有香菇、猴頭、木耳、銀耳、牛肝菌、竹蓀等；少數(shù)屬于子囊菌亞門，如羊肚菌、馬鞍菌、塊菌。食用菌蛋白質(zhì)含量高，脂肪含量低，維生素種類齊全，礦物質(zhì)含量豐富，不含淀粉，具有很高的營養(yǎng)價值。食用菌還含有多糖、甾體、嘌呤等對人體起保健作用的有益成分[1]。

食用菌除具有極大的營養(yǎng)價值和藥用價值外，其抑菌作用逐漸成為新的研究熱點。目前研究主要集中在食用菌水提物、有機溶劑提取物、食用菌發(fā)酵液，越來越多食用菌對人類疾病病原菌、植物病害病原菌、食物腐敗菌抑制作用的研究被報道。研究表明，食用菌含有的一些活性成分對某些種類的微生物有一定的抑制作用。馬學萍等[2]測試了8種食用菌提取物在體外對煙草花葉病毒的鈍化、預防、治療效果，推測提取物中可能含有小分子抗病毒活性物質(zhì)。吳麗萍等[3]研究發(fā)現(xiàn)金針菇、木耳和平菇提取液對西瓜炭疽（Colletotrichum orbiculareArx）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的菌絲生長有一定的抑制活性。劉瑩[4]采用K-B法進行的體外抗菌活性研究表明，3種食用菌粗多糖對革蘭氏陰性菌的大腸桿菌、沙門氏菌及革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌都有抑制性，且抑菌活性都隨著濃度的升高而增強。姜麗等[5]研究發(fā)現(xiàn)木蹄層孔菌Fomes fomentarius（L.: Fr.） Kick.子實體的不同溶劑提取物對白色念珠菌JLC31680、白色念珠菌 JLC31681、大腸桿菌ATCC8099、金黃色葡萄菌ATCC6538均有不同程度的抑制作用。寧安紅等[6]研究發(fā)現(xiàn)篩選出的香菇C91-3菌的深層發(fā)酵液對革蘭氏陰性菌的抑制作用明顯，對革蘭氏陽性菌無效。有研究表明，虎奶菌乙酸乙酯發(fā)酵液對革蘭氏陽性菌的抑制效果顯著高于幾種食品防腐劑[7]。不同品種的食用菌由于產(chǎn)地和所處的生態(tài)地理環(huán)境不同，其所含的有效抑菌成分的種類和含量差別較大。云南省食用菌資源豐富，作為新型植物源殺菌劑先導物的開發(fā)潛力非常大。本實驗室高現(xiàn)亮等[8]已初步研究了11種食用菌水提液對異絲腐霉菌、黑脛病菌、青枯病菌的抑制作用，均表現(xiàn)出一定的抑制活性。鑒于同一種食用菌不同提取方式的抑菌物質(zhì)活性不一樣，本實驗使用4種不同有機溶劑對10種不同食用菌進行提取，并進一步探究其提取液對3種重要煙草病原菌的抑菌效果，旨在找到一種能獲得高抑菌活性成分的提取液溶劑，為研制開發(fā)高效、低毒、無殘留、無污染的植物源殺菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種和菌株

紅蔥（E.americanaMerr.ex Heyne）、黑牛肝（Boletus aereusFr.ex Bull.）、香菇（Lentinus edodes）、塊菌 （Tuber melanosporum）、美味牛肝菌（Boletus edulisBull.ex Franch）、黃牛肝 [Termitomyces eurrhizus(Berk.)Heim]、奶漿菌（Lactarius volemus）、大紅菇（Russula alutaceaFr.）、虎掌菌（Sarcodon imbricatus） 和青頭菌 [Russula virescens（Schaeff.）ex Zanten Fr.]10種食用菌干樣，購自云南昆明木水花野生菌批發(fā)市場。煙草異絲腐霉病菌（Pythium diclinumTokunaga in Ito&Tokunaga）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum） 和黑脛病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae） 由本實驗室培養(yǎng)保存。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

煙草異絲腐霉病菌、黑脛病菌的培養(yǎng)及生長抑制試驗采用燕麥培養(yǎng)基；青枯病菌的培養(yǎng)，用牛肉浸膏瓊脂培養(yǎng)基，生長抑制試驗采用TTC瓊脂培養(yǎng)基，最低抑菌濃度（MIC）的測定采用TTC液體培養(yǎng)基[9]。提取活性成分所用的有機溶劑為無水乙醇、三氯甲烷、乙醚、丙酮，4種試劑均為分析純，重慶川東化工（集團）有限公司生產(chǎn)。烘箱、攪拌機、粉碎機、索氏提取器由本實驗室提供。

1.3 活性成分的提取

將10種食用菌子實體去雜、洗凈，65℃烘干，粉碎備用。稱取各子實體粉5 g，用濾紙包裹起來，線扎實，置于索氏提取器。采用回流提取6 h進行提取，提取完成后，250 mL燒瓶里的溶液定容至20 mL。提取器里的固體風干后稱重，所得提取液置于4℃冰箱備用。

提取液濃度等于提取前粉末重量與提取后干粉重量之差除以定容的體積。

1.4 菌液的制備

將所有供試菌活化2代后，分別接入試管斜培養(yǎng)基，32℃恒溫培養(yǎng)18 h～24 h。試驗時分別取各供試菌株的培養(yǎng)物適量接種于TTC液體培養(yǎng)基內(nèi)，32℃培養(yǎng)16 h～18 h，采用10倍稀釋法，用生理鹽水稀釋至10 000倍備用。

1.5 濾紙片法測定抑菌效果

1.5.1 病原真菌菌絲生長抑制定性實驗

使用直徑0.8 cm的打孔器在濾紙片上打小圓片，試管中進行密封滅菌。無菌條件下，分別將圓片濾紙置于不同溶劑食用菌提取液中浸漬24 h，以提取液溶劑浸漬為對照。用打孔器在已活化的菌株平板中打菌柄，取1塊轉(zhuǎn)入燕麥培養(yǎng)基平板中央。圓片濾紙取出，吸干多余水分，置于平板中央距菌柄2 cm~3 cm處，每皿等距放置3片。28℃恒溫培養(yǎng)2 d~3 d，觀察濾紙圓片周圍抑菌圈的有無及大小。

1.5.2 病原細菌生長抑制定性實驗

使用直徑0.8cm的打孔器在濾紙片上打小圓片，試管中進行密封滅菌。無菌條件下，濾紙片每3個為一組放入不同溶劑食用菌提取液中浸漬24 h，以提取液溶劑浸漬為對照。將配制好的一定濃度的青枯病菌菌懸液0.2 mL，均勻涂布到TTC瓊脂培養(yǎng)基平板上，待風干后，將不同提取液浸泡的圓片濾紙等距置于平板上，每皿3片。32℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察濾紙片周圍抑菌圈有無及其大小。

1.6 最低抑菌濃度（MIC）的測定

采用二倍稀釋法測定食用菌提取液對煙草青枯病菌生長的最低抑菌濃度。將青枯病菌配制成一定濃度的菌懸液。取無菌試管（10mL）若干，排成一排，在各試管中加入1 mLTTC液體培養(yǎng)基，然后在第一支試管中加入1 mL食用菌有機溶劑提取液，混勻，依次從前一支試管中取1 mL混合液加入后一支試管，所得到的濃度為前一支的二分之一。再吸取配置好的一定濃度的青枯病菌菌懸液0.25 mL加入各試管中，封口置于32℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察各試管中顏色變化。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010處理，采用DPS 6.55版本進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種不同溶劑提取10種食用菌得到的提取液對供試菌株的抑制效果

采用生長速率法和抑菌圈法測定抑菌作用的實驗中，各提取液對供試菌株的抑制效果見表1～表3。

（續(xù)表1）

表2 不同有機溶劑的食用菌提取液對煙草黑脛病菌絲生長的抑制效果Tab.2 Inhibitingeffectsofdifferentmushroomextractsbydifferentorganicsolventsonhyphaegrowthof Phytophthoraparasitica var.nicotianae

（續(xù)表2）

表3 不同有機溶劑的食用菌提取液對煙草青枯病菌的抑菌效果Tab.3 Inhibiting effects of different mushroom extracts by different organic solvents on Ralstonia solanacearum

從表1～表3可以看出，用4種不同溶劑提取10種食用菌得到的提取液抑菌效果不同，同一種食用菌的不同溶劑提取液的抑菌效果也不同。不同溶劑提取液對煙草異絲腐霉菌和黑莖病菌的菌絲生長均未表現(xiàn)出明顯的抑制效果，而對煙草青枯病菌的抑制作用有明顯的差異。其中，使用三氯甲烷提取的10種食用菌提取液對煙草青枯病菌抑制效果顯著，以奶漿菌提取液的抑制作用最好，抑菌圈直徑為1.78 cm；使用乙醚提取的10種食用菌提取液中，黑牛肝、塊菌、美味牛肝菌、虎掌菌、青頭菌提取液對煙草青枯病菌有明顯的抑制作用；無水乙醇提取液對煙草青枯病菌的抑制作用次之；丙酮提取液對煙草青枯病菌未表現(xiàn)出抑制活性。

2.2 4種不同有機溶劑的食用菌提取液對煙草青枯病菌的最低抑菌濃度（MIC）

4種不同溶劑提取10種食用菌得到的提取液對青枯病菌的最低抑菌濃度測定結(jié)果見表4。

從表4得知，4種不同有機溶劑提取10種食用菌得到的提取液對煙草青枯病菌的抑制作用有明顯的差異。4種溶劑提取10種食用菌得到的提取液對供試菌的抑菌濃度（MIC）范圍在0.03 mg·mL-1~7.63 mg·mL-1之間；抑菌能力大小順序為三氯甲烷提取液＞乙醇提取液＞乙醚提取液≥丙酮提取液。不同溶劑的提取液抑菌活性有差異，其中以三氯甲烷、乙醇溶劑的提取液抑菌效果最理想，其次為乙醚提取液，丙酮提取液無抑菌活性。

表4 不同有機溶劑的食用菌提取液對煙草青枯病菌的最低抑菌濃度（MIC）Tab.4 The minimal inhibitory concentrations(MIC)of different mushroom extracts by different organic solvents on Ralstonia solanacearum

3 討論

食用菌抑菌效果既與提取物的濃度有關(guān)，與提取溶劑、方法也有一定的相關(guān)性。郝景雯等[10]對長裙竹蓀水提物和乙醇提取物的抑菌活性進行比較，發(fā)現(xiàn)水提物對各供試菌均未顯現(xiàn)出明顯抑制作用，而乙醇提取物的抑菌作用十分顯著。食用菌中含有的活性物質(zhì)對溫度有一定的敏感性。金針菇提取液經(jīng)高溫處理后對西瓜炭疽菌的活性降低，對辣椒疫霉菌反而有促進作用[3]。檀東飛等[11]在關(guān)于棘托竹蓀乙酸乙酯提取物抑菌作用的報道中指出，該菌提取物對蛋白質(zhì)類食物的防腐效果80℃提取物比常溫的好。

本試驗通過對10種食用菌4種不同溶劑的提取液抑菌活性進行比較，結(jié)果表明，各提取液對煙草異絲腐霉菌和黑莖病菌的菌絲生長均未表現(xiàn)出明顯的抑制效果，對煙草青枯病菌的有一定的抑制作用，且抑制強度有顯著性差異。對煙草青枯病菌抑制效果較好的抑菌物質(zhì)主要集中在三氯甲烷和無水乙醇提取液中，尤其是三氯甲烷提取液的抑菌活性最高。有研究表明，提取溶劑對竹蓀抑菌效果的影響大于打漿時間、濃縮程度、浸提溫度[12]。郝景雯等[10]的研究也證實不同溶劑的提取液抑菌活性存在一定差異。據(jù)此可以推測以上10種食用菌含有的抑菌活性物質(zhì)為極性大小不一樣的小分子化合物，不同極性的溶劑對他們的溶解度不一樣，且這些活性成分對不同病原菌的作用機理不一樣，導致抑菌活性存在差異。因此，選擇合適的提取溶劑是獲得食用菌有效活性成分的關(guān)鍵。此外，本試驗還測定了不同溶劑的食用菌提取液對煙草青枯病菌的最低抑菌濃度，為進一步提取、純化抑菌活性成分并對其抑菌機制進行研究提供理論依據(jù)。

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Inhibiting Effects of Mushroom Extracts by Different Solvents on Tobacco Pathogens

ZHONG Yong-li1,GAO Xian-liang1,LUO Hua-yuan2,WANG Na3,DONG Shi-fei2, WANG Wei-dan1,RAO Zhi2,WANG Li-ping3,LAN Jian-qiang1，3
(1.College of Plant Protection,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2.Hongyun-Honghe Group Co.Ltd., Kunming 650231,China;3.College of Tobacco,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)

The inhibiting effects of mushroom extracts by different solvents on three kinds of plant pathogens,Pythium diclinum Tokunaga in Ito&Tokunaga,Phytophthora parasitica var.nicotianae and Ralstonia solanacearum in tobacco were studied by filter paper disc method and the tube double dilution method.The results showed that 10 different edible mushroom extracts obtained by 4 different organic solvents including ethanol,acetone,diethyl ether,trichloromethane had no certain inhibiting effects on Pythium diclinum Tokunaga in Ito&Tokunaga,Phytophthora parasitica var.nicotianae in tobacco,while the inhibiting effects on Ralstonia solanacearum in tobacco were different significantly.The minimal inhibitory concentrations(MIC)of extracts on Ralstonia solanacearum ranged form 0.03 mg·mL-1to 7.63 mg·mL-1.Antibacterial activity was in this order:trichloromethane extract＞ethanol extract＞diethyl ether extract≥acetone extract.

edible mushroom;solvents;pathogen;inhibitory

S646.9

A

1003-8310（2015）01-0044-06

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.01.013

云南中煙資助項目（2011JC-2）。

鐘永麗（1988-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向為生物農(nóng)藥開發(fā)。E-mail:zhongyl21@126.com

**通信作者：蘭建強（1962-），男，博士，教授，主要從事煙草病害防治和生物農(nóng)藥開發(fā)研究。E-mail:jqlan92@163.com

2014-10-17