上海青浦地區結核分枝桿菌基因分型及其人群分布特點

彭榮　費鳳英　張斌

(復旦大學附屬中山醫院青浦分院　a檢驗科，b感染科，上海　201700)

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·論著·

上海青浦地區結核分枝桿菌基因分型及其人群分布特點

彭榮a費鳳英a張斌b

(復旦大學附屬中山醫院青浦分院a檢驗科，b感染科，上海201700)

摘要目的：探討上海市青浦區結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)的主要分型及其人群分布特點。方法： 收集2011年12月—2013年12月上海中山醫院青浦分院分離培養的266株M.tb，分別提取M.tb基因組，應用多重PCR法鑒定北京基因型和非北京基因型，并分析兩種分型在本地區不同性別、年齡及戶籍患者中的分布差異。結果：266株M.tb中，北京基因型菌株242株(90.98%)，非北京基因型24株(9.02%)，差異有顯著統計學意義(χ2=357.32，P<0.01)。進一步研究發現，北京基因型菌株與非北京基因型菌株在不同性別(χ2=0.071，P>0.05)、不同年齡(χ2=0.152，P>0.05)及不同戶籍(χ2=0.053，P>0.05)的人群分布的差異無統計學意義。結論：北京基因型菌株可能是上海市青浦區M.tb的主要流行株，但其分布與性別、年齡及戶籍的關系不明顯。

關鍵詞結核分枝桿菌；基因分型；北京基因型；人群分布

上世紀末，隨著基因研究的深入，人們對結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)有了較深的認識。1995年Van Soolingen等[1]在中國及周邊國家發現了M.tb北京基因型家族，該家族具有相同的IS6110基因標記特征。目前，北京基因型M.tb已在全球傳播，有研究[2]表明其分布約占全球已分離M.tb菌株的13%。北京基因型M.tb作為世界范圍內的第二大流行結核桿菌，具有毒力高、傳播能力強、易突變等特點，能夠逃脫卡介苗的免疫保護，并易產生耐藥甚至耐多藥 (multidrug-resistant，MDR)[3]。國內有學者分別研究了天津[4]、浙江[5]等區域M.tb的基因分型，結果表明北京基因型菌株在這些區域占主導地位，但流行特征不盡相同。為進一步做好上海市青浦區的結核防治工作，本研究分析了2011年12月—2013年12月復旦大學附屬中山醫院青浦分院分離培養的266株M.tb的基因分型，并比較了不同基因型的性別、年齡及戶籍分布差異。

1資料與方法

1.1菌株來源從復旦大學附屬中山醫院青浦分院(該院是上海市青浦區唯一的結核病定點醫院，收治了該地區大多數的肺結核病患者) 2011年12月—2013年12月收治的肺結核患者(排除非M.tb感染者及攜帶多菌種的患者)痰標本中初次分離出培養的266株M.tb，并收集菌株對應患者的性別、年齡以及戶籍信息。H37Rv標準菌株由同濟大學附屬上海市肺科醫院檢驗科惠贈。

1.2主要試劑與儀器羅氏培養基購自上海疾控生物科技有限公司；PCR儀、電泳儀及電泳槽購自美國Bio-Rad公司；快速細菌基因提取試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；引物及Marker由上海劍鈍生物科技有限公司合成。

1.3方法

1.3.1基因組提取將菌株轉種于中性羅氏培養基，37℃孵育4周，待長出后，取菌落，用500 μL含有吐溫-80的磷酸鹽溶液(PBS，pH7.8)充分分散，經80℃水浴2 h滅活后，用快速細菌基因提取試劑盒(Cat:N1152)提取基因組。

1.3.2基因型的鑒定采用經改進的多重PCR方法及瓊脂糖凝膠電泳[6-7]鑒定北京及非北京基因型M.tb。北京基因型菌株上游引物為5′-ACAGGAAGCCGAATGAGGAC-3′，下游引物為5′-CGAAGGAGACCTCGTAGACAAG-3′ (GenBank AF390039)；非北京型基因型菌株上游引物為5′-TGGGTCTGACGACTTGAACAC-3′，下游引物為5′-ACCTTCAGCACCACCATCATC -3′ (GenBank BX842581)。北京基因型和非北京型基因型的目的擴增片段長度分別為261 bp和491 bp。PCR體系的建立：采用15μL體系，引物終濃度為0.2 μmol/L，DNA模板為10～20 ng，2×Master Mix 7.5 μL。PCR反應條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72℃延伸5 min。多重PCR方法的建立[6]：將H37Rv標準株、已確定的北京型基因M.tb和本研究臨床分離的菌株基因組作為模板，用北京及非北京基因型混合引物進行多重PCR擴增。每次試驗均設置無模板對照組。瓊脂糖凝膠電泳：PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠(含4 μL/80 mL的溴化乙錠DNA染料)恒電壓(5V/1cm)電泳，將100 bp DNA leader 作為分子量標志物。應用Bio-Rad凝膠成像系統分析目的基因片段。

1.3.3統計學處理所有數據經SPSS 17.0軟件統計分析。計數資料組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1基因型鑒定266株M.tb中，北京基因型242株(90.98%)，非北京基因型24株(9.02%)，差異有顯著統計學意義(χ2=357.32，P<0.01)。見圖1。

圖1　多重PCR鑒定M.tb的瓊脂糖電泳結果

M：DNA標志物；1：H37Rv標準株擴增條帶491 bp；2：已知北京基因型菌株擴增條帶約261 bp； 3~24泳道為臨床分離株擴增條帶(3，6，9，12，13，14，18泳道為非北京基因型菌株；4，5，7，8，10，11，15~17，19~24泳道為北京基因型菌株)。

2.2兩種基因型M.tb的性別、年齡、戶籍分布266株M.tb中，北京基因型和非北京基因型M.tb在不同性別(χ2=0.071，P>0.05)、不同年齡(χ2=0.152，P>0.05)及不同戶籍(χ2=0.053，P>0.05)人群中的分布差異無統計學意義。見表1。

表1　上海市青浦區兩種基因型M.tb人群分布的基本特征(n,%)

3討論

本研究根據北京基因型菌株基因組中Rv2816和Rv2819序列缺失的特點，采用改進的多重PCR反應鑒定了北京基因型和非北京基因型M.tb，該方法與間隔區寡聚核苷酸分型法(spoligotyping)的鑒定結果一致率為100%[6-7]，而且較spoligotyping分型法簡單易行、經濟實用，因而值得在臨床推廣應用。

盡管國內北京基因型M.tb流行已近半個世紀，但對其流行病學特點還不十分清楚。北京基因型M.tb在世界各地均有發現，但有明顯的地域差異，其中在亞洲達50%左右，而在中國比例更高，達86%[1]。本研究對上海市青浦地區266株M.tb進行了基因分型，發現北京基因型菌株242株(242/266，90.98%)，非北京基因型24株(24/266，9.02%)，差異有顯著統計學意義(χ2=357.32，P<0.01)，表明北京基因型菌株可能是上海市青浦區M.tb的主要流行株。

目前，許多學者對不同地區M.tb不同基因型在人群中的分布特點進行了研究。其中有學者[8]對新疆地區M.tb不同基因型的分布進行了研究，發現北京基因型占43.7%，在維吾爾族和漢族病例中分別占39.5%和72.4%，有明顯的種族差異。也有學者[4]對天津地區的M.tb進行了研究，發現北京基因型和非北京基因型M.tb的性別、年齡分布差異無統計學意義，但戶籍差異有統計學意義。本研究顯示，北京基因型菌株與非北京基因型菌株在不同性別(χ2=0.071，P>0.05)、不同年齡(χ2=0.152，P>0.05)及不同戶籍(χ2=0.053，P>0.05)人群中的分布差異無統計學意義。分析認為，北京基因型M.tb的分布在不同區域及不同人群的研究結果不盡相同，可能是由于其本身亦存在亞型有關，因此有必要對其亞型分布規律做深入研究。

參考文獻

[1]van Soolingen D, Qian L, de Haas P E, et al. Predominance of a single genotype of Mycobacter ium tuberculosis in countries of East Asia[J]. J Clin Microbiol. 1995, 33: 3234 -3238.

[2]Brudey K, Driscoll J R, Rigouts L, et al. Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping data base ( SpolD B4) for classification , population genetics and epidemiology[J] . BMC Microbiol, 2006, 6: 1 -17.

[3]Drobniewski F, Balabanova Y, Nikolayevsky V, et al. Drug-resistant tuberculosis, clinical virulence, and the dominance of the Beijing strain family in Russia[J]. JAMA, 2005, 293 (22):2726-2731.

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[5]馬慧,胡屹,蔣偉，等.中國東部農村地區結核分枝桿菌北京基因型菌株的成簇性及耐藥特征研究[J]. 中華結核和呼吸雜志，2011，34(6)：447-450.

[6]趙德福, 謝彤, 巨韓芳, 等. 利用多重PCR方法快速鑒定結核分枝桿菌北京基因型菌株[J].中國防癆雜志, 2010, 32(6):315-317.

[7]Hillemann D，Warren R，Kubica T．et al．Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype strains by real-time PCR[J]. J Clin Microbiol, 2006, 44 (2):302-306.

[8]吳長東，米利古，龔天美，等.RD105缺失基因檢測法用于結核分枝桿菌新疆“北京家族”臨床分離株的鑒定[J].中國病原微生物雜志，2010,5(3)：161-167.

The Genotyping of Mycobacterium Tuberculosis and Its Characteristics of Population Distribution in Qingpu District of Shanghai City

PENGRongaFEIFengyinaZHANGBinbaLaboratoryDepartment,bInfectionsDepartment,QingpuBranchofZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201700,China

AbstractObjective：To explore the predominant genotyping ofMycobacteriumtuberculosis(M.tb)and its population distribution in Qingpu District of Shanghai City. Methods:A total of 266 M.tb isolates were collected from Qingpu Branch of Zhongshan Hospital from December 2011 to December 2013, of which the genomes were extracted. Bejing genotype and non-Bejing genotype were identified by multiplex polymerase chain reaction(PCR), and the differences regarding distributions in gender, age, and domicile population between the two genotypes were analyzed. Results: Among the 266 M.tb isolates, there were 242 strains(90.98%) of Bejing genotype and 24 strains(9.02%) of non- Bejing genotype，and the difference was statistically significant (χ2=357.32，P<0.01). But there was no significant difference between Bejing genotype and non-Bejing genotype regarding population distribution in different gender (χ2=0.071，P>0.05)， age(χ2=0.152，P>0.05)and domicile (χ2=0.053，P>0.05). Conclusions: The main popular strain of M.tb in Qingpu District of Shanghai City may be Bejing genotype, but its distribution was not significantly related with gender, age and domicile.

Key WordsMycobacteriumtuberculosis;Genotyping;Beijing genotype;Population distribution

通訊作者張斌，Email：zhxy2010@163.com

基金項目：復旦大學附屬中山醫院青浦分院課題(編號：2013K05)

中圖分類號R 378.91+1

文獻標識碼A