注射用頭孢噻肟鈉無菌檢驗的方法學(xué)確認(rèn)

朱蓓芬

（上海新亞藥業(yè)有限公司，上海 201203）

0 引言

注射用頭孢噻肟鈉適用于敏感細(xì)菌所致的肺炎及其他下呼吸道感染、尿路感染、腦膜炎、敗血癥、腹腔感染、盆腔感染、皮膚軟組織感染、生殖道感染、骨和關(guān)節(jié)感染等。根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2010年版）要求，需對其進(jìn)行無菌檢驗。

新版GMP（2010年修訂）第223條規(guī)定，符合下列情形之一的，應(yīng)當(dāng)對檢驗方法進(jìn)行驗證：（1）采用新的檢驗方法；（2）檢驗方法需變更的；（3）采用《中華人民共和國藥典》及其他法定標(biāo)準(zhǔn)未收載的檢驗方法；（4）法規(guī)規(guī)定的其他需要驗證的檢驗方法。

同時，《中華人民共和國藥典》（2010年版）要求，當(dāng)建立產(chǎn)品的無菌檢查法時，應(yīng)進(jìn)行方法的驗證，以證明所采用的方法適用于該產(chǎn)品的無菌檢查。若該產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時，應(yīng)重新驗證檢查方法。

因此，當(dāng)樣品檢驗條件或檢驗方法等發(fā)生改變時，必須對樣品進(jìn)行無菌檢驗的方法驗證試驗。該驗證試驗主要針對該產(chǎn)品在該檢驗條件下的抑細(xì)菌、抑真菌活性及所用的無菌檢查法的可靠性進(jìn)行驗證，以確認(rèn)供試品在該檢查量、檢查條件下無抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不計。依據(jù)《中華人民共和國藥典》（2010年版）附錄（ⅪH）“無菌檢查法”，通過驗證試驗對該產(chǎn)品的檢查方法的可靠性及其結(jié)果的準(zhǔn)確性予以確認(rèn)。

1 試驗所用儀器、試藥、試劑、培養(yǎng)基與菌株

1.1 試驗所用儀器

集菌儀：HTY-601型，杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司；一次性全封閉集菌培養(yǎng)器：NKF330型，杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司；生物安全柜：B-2型，上海基匯生物科技有限公司；垂直流超凈工作臺：ZHJH-C2112B型，上海智城分析儀器制造有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱：HHB11-600型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；脈動真空蒸汽滅菌柜：YXQ-MG-206Ⅱ型/YXQ-MG-206型/YXQ-MG-208型，江蘇張家港市華菱醫(yī)療設(shè)備制造有限公司；分析天平：FA1604S，上海天平儀器廠。

1.2 試驗所用試藥

注射用頭孢噻肟鈉：1.5 g，上海新亞藥業(yè)有限公司。

1.3 試驗所用試劑

蛋白胨（生化試劑）：上海盛思生化科技有限公司；青霉素酶：蘇州金色譜生物技術(shù)有限公司；氯化鈉（分析純）：宜興市達(dá)華化工有限公司；聚山梨酯-80（分析純）：上海申宇醫(yī)藥化工有限公司。

1.4 試驗所用培養(yǎng)基

試驗所用培養(yǎng)基均來自北京三藥科技開發(fā)公司。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（生化試劑）；改良馬丁培養(yǎng)基（生化試劑）；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（生化試劑）；改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（生化試劑）。

1.5 試驗所用菌株

試驗所用菌株均來自上海東方藥品科技實業(yè)有限公司。

金黃色葡萄球菌：CMCC（B）26003；大腸埃希菌：CMCC（B）44102；枯草芽孢桿菌：CMCC（B）63501；生孢梭菌：CMCC（B）64941；白色念珠菌：CMCC（F）98001；黑曲霉：CMCC（F）98003。（1）分裝于25 mm×150 mm小試管中，每管裝量9 m L，管口塞上硅膠塞；（2）分裝于500m L鹽水瓶中，每瓶裝量250m L或500m L，瓶口塞硅膠塞，加鋁蓋，用自動軋蓋機軋蓋，2～25℃保存。

2.1.1.3 含0.05%（V/V）聚山梨酯-80的0.9%無菌氯化鈉溶液（吐溫鹽水）

稱取氯化鈉9 g，加0.5m L聚山梨酯-80，加純化水1 000m L，加熱攪拌溶解。分裝于25mm×150mm小試管中，每管裝量9m L，管口塞上硅膠塞，2～25℃保存。

2.1.2 稀釋劑（試液）、沖洗劑（試液）的滅菌與使用范圍

稀釋劑（試液）、沖洗劑（試液）的滅菌與使用范圍如表1所示。

表1 稀釋劑（試液）、沖洗劑（試液）的滅菌與使用范圍

2 確認(rèn)方法

2.1 稀釋劑（試液）、沖洗劑（試液）確認(rèn)

2.1.1 稀釋劑（試液）、沖洗劑（試液）的配制

2.1.1.1 0.1%蛋白胨水溶液

稱取蛋白胨1.0 g，置1 000 m L搪瓷杯中，加純化水至1 000m L，微溫溶解，過濾。用6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，pH為6.9～7.2。分裝至500m L鹽水瓶中，分裝量500m L/瓶，瓶口塞硅膠塞，加鋁蓋，用自動軋蓋機軋蓋，2～25℃避光保存。

2.1.1.2 0.9%無菌氯化鈉溶液

稱取氯化鈉9 g，加純化水1 000m L，攪拌溶解。

2.2 培養(yǎng)基確認(rèn)

2.2.1 培養(yǎng)基的配制

2.2.1.1 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基

稱取硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基干粉29 g，加入純化水1 000m L，加熱攪拌至沸，使其溶解均勻。用2mol/L鹽酸或6 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，使滅菌后pH為6.9～7.3。100m L鹽水瓶分裝量100m L/瓶，250 m L鹽水瓶分裝量200 m L/瓶，瓶口塞硅膠塞，加鋁蓋，用自動軋蓋機軋蓋，2～25℃避光保存。

2.2.1.2 改良馬丁培養(yǎng)基

稱取改良馬丁培養(yǎng)基干粉28.5 g，加入純化水1 000m L，加熱攪拌至沸，使溶解均勻。用2mol/L鹽酸或6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，使滅菌后pH為6.2～6.6。100m L鹽水瓶分裝量100m L/瓶，瓶口塞硅膠塞，加鋁蓋，用自動軋蓋機軋蓋，2～25℃避光保存。

2.2.1.3 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

稱取營養(yǎng)瓊脂干粉32 g，加入純化水1 000m L，加熱攪拌至沸，使其溶解均勻。用2 mol/L鹽酸或6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，使滅菌后pH值為7.0～7.4。

滅菌雙碟分裝量20m L/只，冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)移至30～35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，檢查無菌即可使用，2～25℃避光保存。

2.2.1.4 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基

稱取改良馬丁瓊脂干粉42g，加入純化水1000m L，加熱攪拌使其至沸，使其溶解均勻。用2 mol/L鹽酸或6 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，使滅菌后pH值為6.2～6.6。

滅菌雙碟分裝量20m L/只，冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)移至23～28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，檢查無菌即可使用，2～25℃避光保存。

2.2.2 培養(yǎng)基的滅菌與使用范圍

培養(yǎng)基的滅菌與使用范圍如表2所示。成1m L含10～100 cfu的菌懸液，2～8℃保存。

2.3.1.2 大腸埃希菌

接種大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物1環(huán)至9m L 0.9%氯化鈉溶液中，用0.9%氯化鈉溶液制成1 m L含10～100 cfu的菌懸液，2～8℃保存。

2.3.1.3 枯草芽孢桿菌

枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物用9m L 0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫，用0.9%氯化鈉溶液制成1m L含10～100 cfu的菌懸液，2～8℃保存。

2.3.1.4 生孢梭菌

生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物用0.9%氯化鈉溶液制成1m L含10～100 cfu的菌懸液，2～8℃保存。

2.3.1.5 白色念珠菌

白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物用9m L 0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫，用0.9%氯化鈉溶液制成1 m L含10～100 cfu的菌懸液，2～8℃保存。

2.3.1.6 黑曲霉

黑曲霉用含0.05%（V/V）聚山梨酯-80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫，制成黑曲霉孢子液，用9m L含0.05%（V/V）聚山梨酯-80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成1m L含10～100 cfu的菌懸液，2～8℃保存。

2.3.2 活菌計數(shù)

表2 培養(yǎng)基的滅菌與使用范圍

2.3 菌液制備的確認(rèn)

2.3.1 菌液制備方法

2.3.1.1 金黃色葡萄球菌

接種金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物1環(huán)至9 m L 0.9%氯化鈉溶液中，用0.9%氯化鈉溶液制

打開薄膜過濾器蓋子，加入50m L 0.1%蛋白胨水溶液，加入1m L含＜100 cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌液，旋緊薄膜過濾器的蓋子，打開抽濾泵過濾，待液體完全抽干后，擰開薄膜，用鑷子拿掉墊圈并取出薄膜。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，白色念珠菌、黑曲霉菌面朝上貼于改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿蓋蓋好。將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌的培養(yǎng)皿倒置于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將白色念珠菌、黑曲霉的培養(yǎng)皿倒置于23～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，計數(shù)。

2.4 沖洗量的確定（加酶試驗）

取注射用頭孢噻肟鈉30瓶，取全量，溶解于500m L 0.9%氯化鈉溶液中作為供試液（供試品含量為0.09 g/m L）。取供試液50m L（相當(dāng)于供試品4.5 g，符合藥典規(guī)定的檢驗量0.15 g/瓶×30瓶）至3張薄膜，過濾后，用1 500m L、2 000m L兩個沖洗量的0.1%蛋白胨水溶液沖洗濾膜（單張薄膜沖洗量為500 m L、667m L），將沖洗液抽干，用針筒抽取青霉素酶6m L至300m L硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，用雙芯針頭取300m L硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基后，將軟管剪斷，用針筒抽取1m L含10～100 cfu試驗菌加入全封閉集菌培養(yǎng)器中，軟管套于空氣濾器開口上，放入30～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察培養(yǎng)結(jié)果。觀察培養(yǎng)結(jié)果詳細(xì)記錄從略。

2.5 無菌試驗（加酶）

2.5.1 酶驗證試驗組

取注射用頭孢噻肟鈉30瓶，取全量，溶解于500 m L 0.9%氯化鈉溶液中作為供試液（供試品含量為0.09 g/m L）。

取供試液50m L（相當(dāng)于供試品4.5 g，符合藥典規(guī)定的檢驗量0.15 g/瓶×30瓶）至3張薄膜，過濾后，單張薄膜用667m L 0.1%蛋白胨水溶液沖洗濾膜，將沖洗液抽干，用針筒抽取青霉素酶4 m L至200 m L硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、抽取2 m L至100 m L改良馬丁培養(yǎng)基中，用雙芯針頭取200 m L硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、100m L改良馬丁培養(yǎng)基后，將軟管剪斷，用針筒抽取1m L含10～100 cfu試驗菌加入全封閉集菌培養(yǎng)器中，軟管套于空氣濾器開口上，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，每天觀察培養(yǎng)結(jié)果。

2.5.2 酶驗證稀釋劑對照組

用500m L 0.9%氯化鈉和2 000m L 0.1%蛋白胨水溶液沖洗濾膜，將沖洗液抽干，用針筒抽取青霉素酶4m L至200 m L硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、抽取2m L至100m L改良馬丁培養(yǎng)基中，用雙芯針頭取200m L硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、100m L改良馬丁培養(yǎng)基后，將軟管剪斷，用針筒抽取1 m L含10～100 cfu試驗菌加入全封閉集菌培養(yǎng)器中，軟管套于空氣濾器開口上，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，每天觀察培養(yǎng)結(jié)果。

2.5.3 酶驗證菌液組

將10～100 cfu試驗菌直接加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或者改良馬丁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d，觀察結(jié)果。

2.5.4 培養(yǎng)方法

培養(yǎng)方法如表3所示。

表3 培養(yǎng)方法

2.5.5 觀察記錄

注射用頭孢噻肟鈉（1.5 g）無菌試驗（加酶）原始記錄從略。

3 確認(rèn)結(jié)果與總結(jié)

3.1 確認(rèn)結(jié)果

3.1.1 沖洗量確定試驗（加酶）

沖洗量確定試驗操作方法進(jìn)行兩次獨立的平行試驗。兩次試驗中：單張膜為667m L 0.1%蛋白胨水溶液的沖洗量，能使陽性菌生長良好；單張膜為500 m L 0.1%蛋白胨水溶液的沖洗量，陽性菌生長緩慢。因此，選用單張膜為667m L 0.1%蛋白胨水溶液的沖洗量作為各試驗菌試驗的沖洗量。

3.1.2 無菌試驗（加酶）

無菌試驗操作方法分3組進(jìn)行兩次獨立的平行試驗。其中，酶驗證試驗組：所有試驗菌均生長良好；酶驗證稀釋劑對照組：所有試驗菌均生長良好；酶驗證菌液組：所有試驗菌均生長良好。因此，檢驗方法成立，可按該方法對供試品進(jìn)行無菌檢查。

3.2總結(jié)

（1）該方法確認(rèn)結(jié)果可行，確認(rèn)過程符合《中華人民共和國藥典》（2010版）與新版GMP要求。

（2）注射用頭孢噻肟鈉無菌檢驗方法可制訂如下：取注射用頭孢噻肟鈉30瓶，取全量，溶解于500 m L 0.9%氯化鈉溶液中作為供試液（供試品含量為0.09 g/m L）。取供試液50 m L（相當(dāng)于供試品4.5 g，符合藥典規(guī)定的檢驗量0.15 g/瓶×30瓶）至3張薄膜，過濾后，單張薄膜用667m L 0.1%蛋白胨水溶液沖洗濾膜，將沖洗液抽干，用針筒抽取青霉素酶4 m L至200 m L硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、抽取2 m L至100m L改良馬丁培養(yǎng)基中，然后用夾子夾住其中一根軟管，用雙芯針頭取200m L硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基至其中兩個全封閉集菌培養(yǎng)器中，再用夾子夾住另兩根軟管，用雙芯針頭取100m L改良馬丁培養(yǎng)基至另一個集菌培養(yǎng)器中，然后將集菌培養(yǎng)器上軟管剪斷，其中一個裝有硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和另一個裝有改良馬丁培養(yǎng)基的集菌培養(yǎng)器，軟管套于全封閉集菌培養(yǎng)器的空氣過濾口上，置培養(yǎng)房中培養(yǎng)14 d，觀察結(jié)果。另一個裝硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的集菌培養(yǎng)器中注入10～100 cfu大腸埃希菌作為陽性對照。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010版）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2]國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品認(rèn)證管理中心.藥品GMP指南：質(zhì)量控制實驗室與物料系統(tǒng)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2011.

[3]藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）[S]，2011.