地氯雷他定對過敏性哮喘豚鼠模型肺組織IL-4R mRNA表達的影響

張 麗，白茹芹南京市胸科醫院藥劑科，南京 009；江蘇省中醫院藥劑科，南京 009

地氯雷他定對過敏性哮喘豚鼠模型肺組織IL-4R mRNA表達的影響

張 麗1，白茹芹2*
1南京市胸科醫院藥劑科，南京 210029；2江蘇省中醫院藥劑科，南京 210029

目的：研究地氯雷他定對過敏性哮喘豚鼠模型肺組織IL-4R mRNA表達的影響。方法：用卵蛋白制備過敏性哮喘豚鼠模型，觀察地氯雷他定對過敏性哮喘豚鼠肺組織病理及IL-4R mRNA表達水平的影響。結果：地氯雷他定能顯著改善過敏性哮喘豚鼠肺組織病理變化，明顯降低肺組織IL-4R mRNA表達水平。結論：降低肺組織IL-4R mRNA的表達可能是地氯雷他定防治哮喘的基因機制。

地氯雷他定；過敏性哮喘；豚鼠；病理；IL-4受體

哮喘是由多種細胞（如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞和氣道上皮細胞等）和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。地氯雷他定是氯雷他定在體內的活性代謝產物，屬于第三代抗組胺藥，研究證實地氯雷他定能抑制肥大細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞釋放細胞因子[2]。本課題組前期研究表明，地氯雷他定能顯著延長過敏性哮喘豚鼠模型哮喘潛伏期，明顯降低哮喘模型豚鼠肺泡灌洗液IL-4和IL-13水平，起到延緩哮喘發作的作用[3]。本研究以地氯雷他定對過敏性哮喘豚鼠模型肺組織病理及IL-4受體（IL-4R）表達的影響，從基因水平探討地氯雷他定防治哮喘的機制。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

地氯雷他定（批號：14STBA001，上海先靈葆雅制藥有限公司）；卵蛋白（武漢生命技術有限公司進口分裝，Sigma）；地塞米松片（天津天藥藥業股份有限公司）；RNA抽提試劑TRIzol、實時定量PCR擴增預混溶液SYBR Green mix（日本Takara公司）；反轉錄試劑盒（美國ABI公司）；引物合成（上海生工公司）。

1.2 儀器

S-888F型超聲霧化器（中外合資南京道芬電子有限分司）；Nanodrop 2000核酸定量儀（美國Thermofish公司）；StepOnePlusTM實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.3 動物

豚鼠，60只，體重160～180 g，雌雄各半，由南京江寧青龍山動物繁殖場提供。實驗動物生產許可證：SCXK（蘇）2012-0013。

2 方 法

2.1 過敏性哮喘豚鼠模型的制備

取豚鼠52只，按文獻方法造模[4]。每只豚鼠腹腔注射10%卵蛋白生理鹽水溶液1 mL，2周后進行引喘，取20 mL的1%卵蛋白生理鹽水注入超聲霧化器，將豚鼠放入霧化箱內，開動霧化器，當豚鼠出現喘促、咳嗽等呼吸道痙攣梗阻癥狀時，表示過敏性哮喘豚鼠造模成功。取出豚鼠，記錄哮喘潛伏期，即霧化開始至豚鼠出現喘促、咳嗽的時間，若潛伏期超過4 min則示造模不成功。

2.2 分組給藥

取造模成功的豚鼠32只，隨機分為4組，每組8只，分別為（1）模型對照組：生理鹽水5 mL·kg-1；（2）地氯雷他定Ⅰ組：0.1 mg·kg-1；（3）地氯雷他定Ⅱ組：0.3 mg·kg-1；（3）地塞米松組：0.1 mg·kg-1。每組豚鼠灌胃給藥，每日1次，連續5 d。末次給藥后1 h，按“2.1”法對豚鼠進行引喘。另取8只正常豚鼠做空白對照。

2.3 肺組織病理切片

完成上述實驗[3]左肺灌洗后，取豚鼠右肺，切取部分肺組織，用4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理狀況。

2.4 組織mRNA提取、反轉錄及qRT-PCR

另取部分肺組織置研缽中，液氮預冷，待組織冷凍后使用研磨器充分研磨，TRIzol法提取組織總RNA，以Nanodrop微量分光光度計檢測RNA濃度及純度。反轉錄試劑盒將1 μg RNA反轉錄合成cDNA，然后在StepOnePlusTM實時定量PCR儀上進行檢測。反應體系包含10 μL SYBR Green mix，3 μL cDNA模板，0.8 μL上下游引物，5.4 μL去離子水。IL-4R上游引物為5'-CTTACCGCAGCTTCAGCGAC-3'，下游引物為5'-CACAGTGGTTGGCTCAGAGA-3'。GAPDH為內參基因，上游引物為5'-CATTGTATCCGTTGTGGATCTGACATGC-3'，下游引物為5'-CCCTGTTGCTGTAGCCATATTTGT-3'。擴增條件為：95℃預變性5 min，接著94℃變性30 s，57℃退火30 s，72°C延伸1 min，擴增35個循環。采用ΔΔCt法分析數據，結果用2ΔΔCt表示。

2.5 統計學處理

3 結 果

3.1 各組豚鼠肺組織病理形態學觀察

空白對照組豚鼠肺組織支氣管和肺泡結構清晰，基本無炎癥細胞浸潤；模型對照組豚鼠支氣管壁、肺間質及肺泡腔內可見以嗜酸性粒細胞、淋巴細胞為主的大量炎癥細胞浸潤；地氯雷他定Ⅰ組豚鼠炎癥細胞浸潤明顯少于模型對照組；地氯雷他定Ⅱ組和地塞米松組豚鼠支氣管壁、肺間質及肺泡腔內偶見嗜酸性粒細胞浸潤，并可見少量淋巴細胞浸潤。HE染色觀察豚鼠肺組織病理學改變見圖1。

圖1 HE染色觀察豚鼠肺組織病理學改變（×200）

3.2 地氯雷他定對過敏性哮喘豚鼠模型肺組織IL-4R mRNA表達的影響

實驗結果顯示，模型對照組與正常對照組比較豚鼠肺組織IL-4R mRNA表達水平顯著升高 （P＜0.01），而給予藥物后肺組織IL-4R mRNA表達水平與模型對照組比較顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），用藥組組間比較無差異（P＞0.05）。結果見圖2。

4 討 論

圖2 地氯雷他定對過敏性哮喘豚鼠模型肺組織IL-4R mRNA表達的影響（±s，n=8）

Th2細胞分泌的多種細胞因子，如白介素4（IL-4）、IL-5和IL-13等，在哮喘發病過程中具有重要作用[5]。IL-4能使嗜酸性粒細胞數目增多，使炎性反應、氣道高反應性增強[6]。IL-13可刺激B細胞的增殖和IgE的合成，后者通過與肥大細胞、嗜堿粒細胞的作用而誘發哮喘的急性發作[7]。IL-4和IL-13的生物活性都是通過與細胞表面相應受體IL-4R或IL-13R結合，繼而激活細胞內多種非受體型蛋白質酪氨酸激酶而完成的[8]。IL-4R的α亞基為IL-13受體的組件之一，因此IL-4和IL-13均可與IL-4R結合發揮生物學效應[9]。本研究顯示，過敏性哮喘豚鼠模型肺組織IL-4R mRNA表達明顯增強，這與以往文獻研究結果一致[10]。目前，口服抗過敏藥物已成為治療輕中度過敏性哮喘的推薦用藥[11]。本實驗中，給予地氯雷他定后，過敏性哮喘豚鼠模型的肺組織病理變化明顯改善，肺組織IL-4R mRNA表達較模型組明顯降低，這可能是地氯雷他定防治哮喘的基因機制。

[1] 陸再英，鐘南山.內科學[M].7版.北京：人民衛生出版社，2008：69.

[2] 徐道華.第三代抗組胺藥地氯雷他定 [J].中國新藥雜志，2005，14（12）：1486-8.

[3] 張 麗，柏立浩，白茹芹.地氯雷他定對過敏性哮喘豚鼠模型肺泡灌洗液IL-4和IL-13水平的影響 [J].實用臨床醫藥雜志，2014，18（16）：105-6.

[4] 徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學[M].北京：人民衛生出版社，1990：1178.

[5] Chung KF.Targeting the interleukin pathway in the treatment of asthma[J].Lancet,2015,386(9998):1086-96.

[6] 楊學敏，史海廣，成家軍，等.白介素4在支氣管哮喘發病機制中的作用及其靶向治療研究 [J].中華哮喘雜志（電子版），2011，5（2）：112-6.

[7] Rayees S,Malik F,Bukhari SI,et al.Linking GATA-3 and interleukin-13:implications in asthma[J].Inflamm Res,2014,63(4):255-65.

[8] Zhou X,Hu H,Balzar S,et al.MAPK regulation of IL-4/IL-13 receptors contributes to the synergistic increase in CCL11/eotaxin-1 in response to TGF-β1 and IL-13 in human airway fibroblasts[J].J Immunol.2012, 188(12):6046-54.

[9] Souza PP,Palmqvist P,Lundberg P,et al.Interleukin-4 and interleukin-13 inhibit the expression of leukemia inhibitory factor and interleukin-11 in fibroblasts[J].Mol Immunol,2012,49(4):601-10.

[10] Bice JB,Leechawengwongs E,Montanaro A.Biologic targeted therapy in allergic asthma[J].Ann Allergy Asthma Immunol,2014,112(2):108-15.

[11] Boulet LP,FitzGerald JM,Reddel HK.The revised 2014 GINA strategy report:opportunities for change[J].Curr Opin Pulm Med,2015,21(1):1-7.

Effects of Desloratadine on the Expression of IL-4 Receptor mRNA in Lung Tissues of Allergic Asthma Guinea Pig

ZHANG Li1,BAI Ru-qin2*
1Depatment of Pharmacy,Nanjing Chest Hospital,Nanjing 210029;2DepartmentofPharmacy,Jiangsu Province Hospital of TCM,Nanjing 210009

Objective:To study the effects of desloratadine on the expression of IL-4 receptor mRNA in lung tissues of allergic asthma guinea pig.Methods:The allergic asthma model of guinea pig was induced by ovalbumin.Then the effects of desloratadine were observed on the pathological changes and the expression of IL-4 receptor mRNA in lung tissues.Results:Desloratadine could improve the pathological changes and decrease the expression of IL-4 receptor mRNA in lung tissues.Conclusion:Decreasing the expression of IL-4 receptor mRNA in lung tissues may be the mechanism of desloratadine in treating asthma.

Desloratadine;Allergic asthma;Guinea pig;Pathology;IL-4 receptor

R965.1

A

1673-7806（2015）06-552-03

張麗，女，主管藥師 E-mail:njchzli@tom.com

*通訊作者白茹芹，女，副主任藥師 E-mail:1537084738@qq.com

2015-05-27

2015-07-20