LC-MS法同時測定至靈菌絲膠囊中5種成分的含量*

張先林，戴國梁，丁 康，貢 濤，陳志遠，居文政**

江蘇省中醫院1藥學部，2臨床藥理科，南京 210029；3南京中醫藥大學第一臨床醫學院，南京 210029

LC-MS法同時測定至靈菌絲膠囊中5種成分的含量*

張先林1，戴國梁2，丁 康3，貢 濤3，陳志遠1，居文政2**

江蘇省中醫院1藥學部，2臨床藥理科，南京 210029；3南京中醫藥大學第一臨床醫學院，南京 210029

目的：建立同時測定至靈菌絲膠囊中腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤含量的方法。方法：采用液相色譜串聯質譜（LC-MS）法。色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱，流動相為甲醇-0.1%甲酸溶液，采用電噴霧電離源，多反應離子監測（MRM），用于定量分析的5種成分檢測離子對m/z分別為268.1/136、244.2/112.1、284.1/152.1、183.1/69、136.1/119.1。外標法定量分析。結果：5種成分的質量濃度分別在37.5～1200、20～640、40～1280、77.5～2480、27.5～880 ng·mL-1范圍內與各自的峰面積呈良好的線性關系（r=0.9985、0.9964、0.9991、0.993、0.9924）。加樣回收率在95.7%～101.4%范圍內，RSD均低于7.3%。結論：該法專屬性強、快速靈敏，可用于至靈菌絲膠囊中5種成分的含量測定。

至靈菌絲膠囊；腺苷；胞苷；鳥苷；甘露醇；腺嘌呤；液相色譜串聯質譜法

蛹蟲草（Cordyceps militaris（L.）Link）又名北冬蟲夏草、北蟲草，是由子座（草部分）與菌核（蟲的尸體部分）組成的復合體[1]，具有緩解腦溢血和腦血栓、抑制癌細胞生長、增強機體免疫功能、降血糖、抗衰老等[2-3]多種功效。蛹蟲草含有腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤等成分[4-5]，且容易人工栽培[6-7]，因此蛹蟲草目前被選為冬蟲夏草的最佳替代品。

至靈菌絲膠囊主要成分為蛹蟲草，該制劑主要具有補腎養肺、固精益氣、增強免疫力之功效。本研究旨在建立一種選擇性好、快速簡便的液相色譜串聯質譜法同時測定至靈菌絲膠囊中5種成分的質量濃度，為控制至靈菌絲膠囊的質量提供科學依據。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

至靈菌絲膠囊（江蘇省中醫院，批號：1312004、1401002、130203）。標準品：腺苷（批號：13081813，純度：99.2%）、胞苷（批號：13062509，純度：98.9%）、鳥苷（批號：13091006，純度：99.3%）、甘露醇（批號：13110812，純度：99.5%）、腺嘌呤（批號：13120812，純度：99.2%），均為成都普瑞法科技開發有限公司提供。甲酸、甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.2 儀器

Agilent 1290高效液相色譜儀（含Agilent 6430 LC-MS三重四級桿質譜儀，配有電噴霧化離子源（ESI），MassHunter色譜工作站，美國安捷倫公司）；AE240電子天平 （上海梅特勒-托利多有限公司）；MICRO-17R冷凍離心機（美國Thermo公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB C18柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（5∶95，v/ v）；流速：200 μL·min-1；柱溫：35℃；進樣量：2 μL；自動進樣方式。離子化模式：正離子；定量模式：多反應監測模式（MRM）；毛細管電壓：4000 V；干燥氣溫度：400℃。確定化合物母離子后，在SIM模式下，對化合物的碎裂電壓（Fragmentor）進行優化；母離子發生斷裂或重排等反應產生不同的離子碎片。在Product Ion模式下，對化合物母離子施加一定量的碰撞能量（CE），得到其相應的離子碎片，最后在分段多反映離子監測（MRM）模式下，優化目標物離子最佳碰撞能量。腺苷的Fragmentor及CE值分別為100V、20V；胞苷的Fragmentor及CE值分別為100V、10 V；鳥苷的Fragmentor及CE值分別為90V、10 V；甘露醇的Fragmentor及CE值分別為70V、10 V；腺嘌呤的Fragmentor及CE值分別為100 V、30 V；檢測對象：腺苷m/z 268.1→m/z 136；胞苷m/z 244.2→m/z 112.1；鳥苷m/z 284.1→m/z 152.1；甘露醇m/z 183.1→m/z 69；腺嘌呤m/z 136.1→m/z 119.1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液 分別取腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤標準品適量，精密稱定，用50%甲醇溶解并定容，制成5種成分的質量濃度分別為1200、640、1280、2480、880 ng·mL-1的混合對照品溶液。依次進行倍比稀釋，外標法定量分析。結果見表1。

表1 5種成分對照品LC-MS/MS分析濃度信息/ng·mL-1

2.2.2 供試品溶液 取符合膠囊制劑要求的至靈菌絲膠囊內容物，混勻，精密稱定0.5 g，置50 mL量瓶中，用90%甲醇溶解并定容，超聲處理30 min（功率：45 kHz），搖勻，濾過。精密吸取續濾液1 mL，置5 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。按“2.1”項下試驗條件下進行測定，見圖1。

圖1 液-質聯用MRM離子流圖

2.3 線性關系考察

精密吸取“2.2.1”項下系列混合對照品溶液各2 μL，按照“2.1”項下試驗條件進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標，濃度（X，ng·mL-1）為橫坐標，繪制標準曲線，結果見表2。結果表明，腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤的質量濃度在相應范圍內與峰面積呈良好線性關系。

表2 至靈菌絲膠囊中5種成分的線性回歸結果

2.4 精密度試驗

取低、中、高3個濃度（選取HB5、HB4、HB2）的混合對照品分別重復進樣5次，進樣量2 μL，按“2.1”項下實驗條件進行測定，記錄峰面積。結果腺苷的RSD分別為2.3%、2.7%、3.5%（n=5）；胞苷的RSD分別為1.2%、3.4%、5.1%（n=5）；鳥苷的RSD分別為2.5%、2.6%、3.1%（n=5）；甘露醇的RSD分別為3.5%、1.2%、1.9%（n=5）；腺嘌呤的RSD分別為4.2%、4.3%、3.9%（n=5）。

2.5 穩定性試驗

取樣品（批號：1312004）5份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫放置于進樣室中，分別放置0、4、8、12、24 h按“2.1”項下實驗條件進樣測定，記錄峰面積。結果腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤峰面積的 RSD分別為 1.6%、4.3%、3.8%、2.2%、2.9%（n=5），結果表明供試品溶液在24 h內穩定性均較好。

2.6 重復性試驗

取樣品（批號：1312004）6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下實驗條件進樣測定，記錄峰面積。結果腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤峰面積的RSD分別為1.2%、1.4%、1.6%、2.1%、1.4%（n=6），表明方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一批樣品 （批號：1312004）約0.25 g各3份，分別精密加入各對照品溶液適量，按“2.2.2”項下方法制備，依法測定，計算回收率，結果加樣回收率在95.7%～101.4%，RSD均低于7.3%。

2.8 樣品含量測定

取3批至靈菌絲膠囊，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣2 μL，并按“2.1”項下條件測定，計算各批膠囊中腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤的含量，結果見表3。

表3 至靈菌絲膠囊中5種成分含量測定結果（n=3）/μg·g-1

3 討 論

本研究前期曾采用高效液相色譜法（HPLC法）檢測至靈菌絲膠囊中的成分，但各成分相互干擾嚴重，無法進行準確的定量分析，多成分含量同時測定色譜條件摸索困難等問題。

通過對不同規格的色譜柱進行比較，結果采用Agilent Zorbax SB C18色譜柱所得色譜峰保留時間適中，峰形較好。試驗中分別嘗試采用正、負2種離子模式，發現正離子模式下的離子化效率明顯高于負離子模式。同時，考察了流動相的組成與比例對分析結果的影響，結果表明，當甲醇與0.1%甲酸水溶液的比例為5∶95時，5種成分分離良好，彼此不會相互影響，且均在4 min內出峰。

《中國藥典》2010版中載有蛹蟲草的制劑（金水寶膠囊、金水寶片），僅采用HPLC法測定其中腺苷的含量，而本研究采用LC-MS/MS法同時測定至靈菌絲膠囊中腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤的含量，該方法具有干擾少、分析時間短、靈敏度高、專屬性強的特點，為科學控制至靈菌絲膠囊質量提供了可靠而簡捷的方法。

[1] 鄭婷婷，李多偉，王英娟，等.蛹蟲草液體培養條件優化及有效成份含量分析[J].菌物研究，2004，2（4）：22-4.

[2] 凌建亞，孫迎節，呂 鵬，等.蟲草屬真菌中蟲草素的超聲波提取及其毛細管電泳測定 [J].菌物系統，2002，21（3）：394-7.

[3] 夏春雨，孫 巍，劉學銘.蟲草有效成分的研究進展[J].中國食用菌，2009，28（2）：3-6.

[4] 貢成良，吳友良，朱軍貞，等.家蠶蛹蟲草的人工培育及其成分分析[J].中國食用菌，1989，12（4）：21-4.

[5] 劉靜明，鐘裕容，楊 智，等.蛹蟲草化學成分研究[J].中國中藥雜志，1989，14（10）：32-6.

[6] 張紅霞，吳 畏，陳 偉，等.北冬蟲夏草發酵液中蟲草素和腺苷含量的HPLC分析[J].上海農業學報，2005，21（4）：53-7.

[7] 王 瑩，鐵 梅，康平利，等.ICP-MS等三種測定蛹蟲草硒含量方法的比較 [J].光譜學與光譜分析，2009，29（3）：815-8.

Simultaneous Determination of Five Components in Zhiling Junsi Capsules by LC-MS*

ZHANG Xian-lin1,DAI Guo-liang2,DING Kang3,GONG Tao3,CHEN Zhi-yuan1,JU Wen-zheng2**
1Department of Pharmacy,2Department of Clinical Pharmacology,the Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine(TCM),Nanjing 210029;3First School of Clinical Medicine,Nanjing University of TCM,Nanjing 210029

Objective:To develop an LC-MS method for the determination of adenosine,cytidine, guanosine,mannitol and adenine in Zhiling Junsi capsules.Methods:Isocratic elution was carried out with mobile phase consisting of methanol-0.1%formic acid.The separation was performed on Agilent Zorbax SB-C18column,and the mass spectrometer was operated in the positive electrospray ionization (ESI)mode using multiple reaction monitoring(MRM)for the analysis of five components.The precursor to product ionm/ztransitions monitored for adenosine,cytidine,guanosine,mannitol and adenine were 268.1/136,244.2/ 112.1,284.1/152.1,183.1/69 and 136.1/119.1,respectively.An external standard method was used for quantitation.Results:Adenosine,cytidine,guanosine,mannitol and adenine were all analyzed exactly,the linear ranges were 37.5-1200,20-640,40-1280,77.5-2480 and 27.5-880 ng·mL-1,respectively.The linear coefficients were 0.9985,0.9964,0.9991,0.9935 and 0.9924,respectively.The recoveries of the five analytes ranged from 95.7%to 101.4%and the relative standard deviations were all within 7.3%.Conclusions:A sensitive,accuracy and suitable LC-MS method has been developed,and the method can be applied for the determination of adenosine,cytidine,guanosine,mannitol and adenine in Zhiling Junsi capsules.

Zhiling Junsi Capsule;Adenosine;Cytidine;Guanosine;Mannitol;Adenine;LC-MS

R927.2

A

1673-7806（2015）06-543-03

科技部重大新藥創制科技重大專項 （No.2012ZX-09303009-002）；江蘇省中醫藥領軍人才（LJ200906）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目（ysxk-2010）

張先林，男，本科，副主任中藥師，研究方向：醫院藥學E-mail:CL19890525@126.com

**通訊作者居文政，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：中藥臨床藥代動力學 E-mail:wzhju333@163.com

2015-08-26

2015-11-09