益氣養陰化濁通絡方對糖尿病腎病大鼠轉化生長因子-β1/Smads信號通路的影響

卞　華　呂　芹胡久略　毛秉豫　葉松山(南陽理工學院醫學實驗中心，河南　南陽　473004)

益氣養陰化濁通絡方對糖尿病腎病大鼠轉化生長因子-β1/Smads信號通路的影響

卞華呂芹1胡久略毛秉豫葉松山
(南陽理工學院醫學實驗中心，河南南陽473004)

〔摘要〕目的觀察益氣養陰化濁通絡方對糖尿病腎病(DN)大鼠轉化生長因子(TGF) -β1/Smads信號通路的影響，探討其對DN的作用機制及治療效果。方法選擇50只健康雄性SD大鼠，隨機分為正常組10只，造模組40只。造模組大鼠接受單側腎切除手術2 w后，給予高糖高脂飲食4 w，再加用小劑量鏈脲佐菌素(30 mg/kg)腹腔注射，造模組在DN模型成模后，隨機分為模型組、中藥組、西藥組。中藥組給予益氣養陰化濁通絡方煎劑，西藥組給予貝那普利，治療8 w后處死大鼠。測定血糖、24 h尿蛋白定量、血尿素氮及肌酐的變化，同時檢測腎組織TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白的表達。結果與模型組相比，中藥組血糖、24 h尿蛋白量、血尿素氮及肌酐均顯著降低(P＜0.01)，TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達下調，Smad7蛋白表達增強(P＜0.05，P＜0.01)。結論在DN大鼠模型中，益氣養陰化濁通絡方能夠改善腎功能，保護腎組織，調節TGF-β1/Smad信號通路是其作用機制之一。

〔關鍵詞〕糖尿病腎病;益氣養陰化濁通絡方;轉化生長因子(TGF) -β1; Smad蛋白

1南陽醫學高等專科學校中醫系

第一作者:卞華(1973-)，男，副教授，博士，主要從事中醫藥治療內分泌疾病的研究。

糖尿病腎病(DN)的主要病理表現為腎小球肥大，細胞外基質(ECM)增生，腎小球系膜區增寬及毛細血管基底膜增厚，最后進展至腎小球硬化和腎間質纖維化。研究表明轉化生長因子(TGF) -β1/Smads信號轉導通路在DN的發生發展中起著重要作用〔1，2〕。本文前期臨床研究顯示，益氣養陰化濁通絡方能改善DN患者血清TGF-β1、基質金屬蛋白酶(MMP) -9及基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP) -1水平，降低結締組織生長因子(CTGF)、Ⅳ型膠原水平而延緩DN的發展〔3，4〕。本研究旨在觀察益氣養陰化濁通絡方對DN大鼠TGF-β1/Smads信號通路的干預作用，以進一步探討其對DN的治療作用及抗腎臟纖維化的機制。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑益氣養陰化濁通絡方煎劑，由黃芪、太子參、葛根、薏苡仁各30 g，生地黃、丹參各20 g，鬼箭羽15 g，絲瓜絡、白芥子、穿山甲各10 g等藥物組成，該方一劑共含生藥220 g，水煎濃縮后使藥液濃度相當于生藥2.5 g/ml，2 000 r/min離心5 min，取上清液，置－20℃冰箱保存備用。貝那普利片: 10 mg，北京諾華制藥有限公司，批號x1377。鏈脲佐菌素(STZ) (美國Sigma公司) ;血肌酐(Scr)試劑盒、血尿素氮(BUN)試劑盒(南京建成生物工程有限公司) ;兔抗大鼠TGF-β1抗體、山羊抗鼠磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)多克隆抗體、兔抗鼠Smad7單抗(美國Santa Cruz公司) ;辣根過氧化物酶標記IgG二抗(美國KPL公司) ; BCA蛋白檢測試劑盒(美國Pierce公司)。

1.2DN模型制備及分組〔5，6〕雄性SD健康成年大鼠，體重(220±10) g，由鄭州大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK(豫) 2010-0002。選用清潔級健康雄性SD大鼠50只，普通飼料適應性喂養1 w，分別檢測血糖、尿糖和尿蛋白均為陰性者用于實驗。隨機選取10只大鼠行左腎摘除假手術操作，作為正常組，其余40只大鼠行左腎摘除術，5萬U青霉素腹腔沖洗并注射后縫合。手術后肌注2萬U青霉素，共1 w。手術后2 w，正常組普通飼料喂養，其他各組給予高脂高糖飼料(60％普通飼料、10％的豬油、5％膽固醇、5％蛋黃粉和20％蔗糖)，隨日齡增加，投料相應增多。4 w后，造模組大鼠一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg(用0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解，pH值4.2～4.5，配制成2％STZ溶液)，正常組大鼠一次性腹腔內注射等體積不含STZ的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后，以3次連續隨機尾靜脈血糖≥16.7 mmol/L，尿糖強陽性()～()、尿量大于正常組的50％，24 h尿蛋白定量在30 mg以上者為DN造模成功。其中手術過程中意外死亡4只，2只大鼠血糖未達標準，剔除。造模組在DN模型成模后1 w，隨機分為模型組(11只)、西藥組(11只)、中藥組(12只)。DN模型成模1 w后開始給藥，正常組、模型組每天生理鹽水灌胃，西藥組予貝那普利1.0 mg·kg-1·d-1灌胃，中藥組予中藥煎劑22.9 g·kg-1·d-1灌胃，每日上午10∶00左右給藥1次，連續給藥8 w。實驗期間，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.3生化指標的檢測給藥結束后，取大鼠股動脈血，分離血清，BECKMAN CX7全自動生化分析儀檢測血糖、Scr、BUN。24 h尿蛋白定量用雙縮脲法測定。

1.4TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白檢測Western印跡法檢測。收集的腎組織加入蛋白裂解液裂解，冰浴30 min。4℃10 000 r/min離心10 min，收集上清，用BCA蛋白檢測試劑盒進行蛋白定量，－70℃保存。取60 μg蛋白按常規方法進行10％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至PVDF膜。按0.1 ml/cm2加入封閉液，室溫封閉2 h后，依次加入一抗(1∶1 000稀釋)，室溫下輕搖2 h，4℃孵育過夜。棄去反應液，用TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min;加入二抗(1∶2 000稀釋)，37℃孵育1 h，用TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min。ECL發光試劑對硝酸纖維素膜進行顯色反應，用Bio Rad-Image Lab全自動電泳凝膠成像系統分析儀成像并對免疫印跡條帶進行半定量分析，用β-actin作內參照，以與β-actin的比值表示各組蛋白表達水平。

2　結果

2.1各組大鼠血糖、尿蛋白、Scr、BUN變化情況的比較與正常組相比，模型組及兩治療組血糖、24 h尿蛋白定量、Scr、BUN均明顯增高(P＜0.01) ;與模型組相比，兩治療組24 h尿蛋白定量、Scr、BUN及中藥組血糖均明顯降低(P＜0.05，P＜0.01) ;與西藥組相比，中藥組血糖、24 h尿蛋白定量、Scr顯著降低(P＜0.01)。見表1。

2.2益氣養陰化濁通絡方對DN大鼠TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表達的影響Western印跡檢測顯示，與正常組相比，模型組、西藥組、中藥組TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7表達水平均異常(P＜0.05，P＜0.01) ;與模型組相比，西藥組、中藥組TGF-β1、p-Smad2/3表達降低，Smad7表達升高(P＜0.01) ;與西藥組相比，中藥組TGF-β1、p-Smad2/3表達改善更明顯(P＜0.05)。見表2，圖1。

表1　各組大鼠血糖、尿蛋白、Scr、BUN比較(±s)

表1　各組大鼠血糖、尿蛋白、Scr、BUN比較(±s)

與正常組比較: 1) P＜0.05，2) P＜0.01;與模型組比較: 3) P＜0.05，4) P＜0.01;與西藥組比較: 5) P＜0.05，6) P＜0.01，下表同

組別　n　　血糖(mmol/L)　　尿蛋白(mg/24 h)　Scr(μmol/L)　BUN(mmol/L)正常組模型組西藥組中藥組10 11 11 12 5.05±0.39 26.43±0.692)26.16±0.932)18.42±1.022) 4) 6)7.04±0.39 61.11±4.192)38.95±3.302) 4)34.75±3.362) 4) 5)45.44±5.46 137.56±5.682)89.43±6.672) 4)72.66±7.052) 4) 6)5.13±0.21 9.77±1.162)8.48±0.662) 3)8.22±0.562) 4)

表2　各組大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表達的變化(±s)

表2　各組大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表達的變化(±s)

組別　n　 TGF-β1　p-Smad2/3　Smad7正常組模型組西藥組中藥組10 11 11 12 0.212±0.035 0.804±0.0712)0.451±0.0622) 4)0.367±0.0421) 4) 5)0.189±0.014 0.795±0.0522)0.516±0.0372) 4)0.328±0.0251) 4) 5)0.511±0.042 0.176±0.0132)0.268±0.0322) 3)0.305±0.0262) 4)

圖1　Western印跡分析TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7在各組大鼠腎組織中的表達

3　討論

TGF-β1是導致DN的關鍵性因子，高血糖、血管緊張素Ⅱ、糖基化終末產物等是激活TGF-β1/Smads信號通路的重要因素〔7〕。TGF-β1活化后與其受體結合，通過Smads蛋白將細胞外信號轉導入細胞內，誘導腎小球及腎小管細胞肥大，促進ECM積聚，抑制ECM的降解，導致腎間質纖維化〔8〕。

Smads作為TGF-β1細胞內信號傳遞分子，調控細胞膜信號轉導，活化型和輔助型Smad蛋白是正調控分子，而抑制型Smad蛋白是負調控分子。Smad2、Samd3是活化型Smad蛋白，為TGF-β1下游調節因子，在DN動物模型中均高表達，提示Smad2/Smad3在DN纖維化過程中起了重要作用〔9〕。Smad7為抑制型Smad蛋白，可與Smad2或Smad3競爭結合TGF-β受體Ⅰ，抑制Smad2 /Smad3磷酸化及向細胞核轉移，增加泛素介導的TGF-β受體Ⅰ自身的降解，從而負性調節TGF-β1/Smad通路。Smad7作為內源性TGF-β1拮抗劑，抑制TGF-β1/Smads信號通路已得到公認〔10〕。因此，抑制TGF-β1的產生和(或)活性，拮抗或阻斷TGF-β1/Smads信號途徑可以減輕實驗性腎纖維化的進展〔11〕。

本研究結果顯示，經益氣養陰化濁通絡方治療后，DN大鼠尿蛋白排泄減少，腎功能得到恢復，提示益氣養陰化濁通絡方具有抗纖維化作用，模型組TGF-β1、p-Smad2/3表達升高，表明存在TGF-β1/Smads信號轉導通路的活化。與模型組比較，中藥組TGF-β1、p-Smad2/3的表達有所下降，Smad7蛋白表達有所增強，說明益氣養陰化濁通絡方能上調腎臟組織中Smad7蛋白的表達，抑制TGF-β1、p-Smad2/3的表達，從而抑制TGF-β1/ Smads信號轉導通路，發揮抗DN腎臟纖維化的作用。

4　參考文獻

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〔2014-08-12修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項目:河南省中醫內科學重點學科支撐課題(2012) ;河南省中醫學實驗教學示范中心建設項目(2010)

〔中圖分類號〕R259

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4432-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.006