魯北地區60例大腸癌組織中IDO的表達及臨床意義

趙　碩,王榮華，李保松,傅廷亮，崔運福

(濱州醫學院附屬醫院 a.肛腸外科, b.小兒外科，山東 濱州 256600)

魯北地區60例大腸癌組織中IDO的表達及臨床意義

趙碩a△,王榮華a※，李保松a,傅廷亮b，崔運福a

(濱州醫學院附屬醫院 a.肛腸外科, b.小兒外科，山東 濱州 256600)

由于人口老齡化加快、不良的生活方式、環境污染以及遺傳等多種因素的影響，我國大腸癌的發病率和病死率在逐年上升，對現有的治療策略提出了嚴重挑戰。近年來，在現有的綜合治療中，腫瘤的生物免疫治療的地位愈來愈受到重視，它因具有全身性治療特點，可與手術、放療或區域化療等局部治療相結合，已經成為腫瘤的第四類治療模式[1]，并已在臨床應用中取得了一定的療效。吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)作為近年來研究較熱的因子之一，已有較多研究表明與腫瘤免疫耐受的關系密切[2-3]。同時,p53作為一種公認的抑癌基因，亦有大量研究證明p53在大腸癌的發生、發展中起重要作用[4-5]。因此，本研究通過免疫組織化學法檢測魯北地區IDO在大腸癌中的表達情況，分析其表達的臨床意義，并進一步比較與p53間的相關性，初步探討IDO在大腸癌進展及轉移中的作用，為大腸癌在今后的免疫治療以及臨床評估方面提供一定的理論依據。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2009年6月至2010年5月濱州醫學院附屬醫院經病理科診斷為大腸癌的成套石蠟組織標本60例，包括腫瘤原發灶、癌旁大腸上皮組織(距腫瘤原發灶≤3 cm且鏡下觀察正常)和引流區域淋巴結。術前均未接受放、化療等抗腫瘤治療，其中男33例、女27例，年齡36～77歲，平均(59±7)歲，≥60歲28例，<60歲32例。

1.2免疫組織化學法采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶連結法(SP法)進行免疫組織化學染色，該技術通過抗原抗體的特異性結合以及呈色反應，可在組織或細胞中對待測抗原進行準確定位，具有高敏感性、操作簡便、非特異背景低的特點。主要過程：將石蠟包埋的組織片切片置于60 ℃恒溫箱60 min，行防脫片處理→常規脫蠟至水化→濕盒中滴加3% H2O2去離子水，滅活內源性過氧化物酶→將切片浸入枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)中，微波爐加熱，沸騰后斷電自然冷卻10 min后再次加熱至沸騰，如此反復2次，行抗原修復→滴加5%牛血清白蛋白封閉液，室溫20 min→滴加一抗：比例為1∶80稀釋MAB5412-小鼠抗人IDO單克隆抗體(Clone10.1)(Millipore公司，美國)，4 ℃孵育過夜→滴加鏈霉親和素-生物素復合物免疫組織化學染色試劑盒(武漢博士德生物)→二氨基聯苯胺顯色(二氨基聯苯胺顯色試劑盒由北京中杉金橋公司提供)，鏡下觀察以控制反應時間→依次蘇木精復染、鹽酸酒精分化、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，最后中性樹膠封片保存。用磷酸鹽緩沖液)代替一抗設為陰性對照，用已知高表達組織作為陽性對照。

1.3結果判定IDO陽性表達定位于細胞質，陽性細胞為相應部位染成黃色或棕黃色。每張切片均由兩位病理醫師雙盲閱片。先采用半定量積分法[6]，計算每張切片的陽性細胞率，先在低倍(×100)光學顯微鏡下，每張切片選取10個IDO陽性細胞代表視野，在高倍鏡(×400)下每個視野隨機計數100個細胞，共1000個細胞，采用陽性細胞數/計數細胞總數×100%得出每張切片的陽性細胞率。其中0分(≤5%)，1分(6%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(≥76%)；

再分別對每張切片的陽性細胞顯色強度記分:0～3分依次為無著色、淡黃色、黃色、棕黃色。然后上述兩者積分的乘積：0～2為陰性(-)，3～5為弱陽性(+)，6～8為中陽性(++)，9～12為強陽性(+++)[7]。最后取(-～+)為IDO低表達，(++～+++)為IDO高表達。

1.4統計學方法應用SPSS 19.0統計學軟件進行數據處理,計數資料比較采用χ2檢驗，IDO與p53間的相關性采用Spearman等級相關分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1IDO在60例大腸癌組織中的表達情況IDO在腫瘤原發灶、癌旁組織以及區域淋巴結中可呈現強弱不等的表達(圖1～4，見封三)，在大腸癌原發灶、癌旁正常上皮組織、有淋巴結轉移灶及無淋巴結轉移淋巴結中的IDO高表達率分別為75.0%(45/60)、18.3%(11/60)、35.3%(12/34)、50.0%(13/26)，IDO在大腸癌原發灶中高表達率顯著高于癌旁正常上皮組織(χ2=38.705,P<0.05)；在34例伴有區域引流淋巴結轉移灶中，與相應的原發灶高表達率52.3%(28/34)相比，IDO的表達率明顯下調(χ2=15.543,P<0.05)，與相應34例癌旁正常組織高表達率17.6(6/34)相比，差異無統計學意義(χ2=2.270,P>0.05)；而在26例無腫瘤轉移的淋巴結中高表達率為5.0%(13/26)，與相應的原發灶高表達率65.3%(17/26)相比，IDO的表達差異無統計學意義(χ2=1.261,P>0.05)，與相應26例癌旁正常組織高表達率19.2%(5/26)相比，差異有統計學意義(χ2=5.438，P<0.05)。

2.2IDO在大腸癌原發灶中的表達與患者臨床病理特征的關系在60例大腸癌原發灶中，有45例呈現高表達，通過結合患者臨床病理特征進行統計學分析，結果顯示，C/D期較A/B期高表達，N1-2較N0期高表達，p53陽性較陰性高且達(P<0.05)。見表1。

表1　IDO在大腸癌原發灶中的表達強度與

IDO：吲哚胺2，3-雙加氧酶

2.3大腸癌原發灶中IDO和p53表達的相關性分析Spearman等級相關分析結果顯示，IDO和p53表達呈顯著正相關(rs=0.352,P=0.006)。見表2。

表2　大腸癌原發灶中IDO與p53表達的相關性分析　(例)

IDO：吲哚胺2，3-雙加氧酶

3討論

IDO作為肝外唯一催化色氨酸(Trp)沿犬尿酸途徑代謝的限速酶，最早由Osamu Hayaishis研究組在兔的腸道中發現[8]，此后還被證實分布于人和動物(如大鼠等)除肝臟以外的組織中。在人類，此途徑能降解約90%的色氨酸，其主要代謝產物有犬尿氨酸、喹啉酸等。IDO在干擾素γ等的誘導下可表達上調，通過降解色氨酸使其水平降低，從而抑制病毒等病原體的增殖，參與免疫調節。IDO除了預防病原體外，還參與調節T細胞的免疫反應，從而參與免疫耐受，與自身免疫性疾病、移植免疫及生殖免疫密切相關[2]。

近年來越來越多的研究證明IDO與腫瘤免疫耐受的關系密切，國內外學者通過對多種惡性腫瘤細胞系檢測，證實了IDO在腫瘤組織中的高表達現象[9-10]。并且大量研究進一步表明IDO參與腫瘤的免疫耐受，目前較為達成一致的觀點是IDO在腫瘤微環境中可能主要通過色氨酸耗竭機制、Trp產物的毒性機制、誘導調節性T細胞增殖3種機制來抑制局部T細胞活化、增殖等免疫反應，其中Trp的代謝產物(如喹啉酸等)的毒性作用可直接使T細胞、自然殺傷細胞凋亡[10]，從而使腫瘤細胞逃避免疫系統的攻擊，參與腫瘤的發生、發展。本研究通過對60例大腸癌原發灶中的IDO檢測，其高表達率為75.0%，與相應癌旁正常大腸組織(18.3%)比較差異有統計學意義(P<0.05)，這與大多數學者認為腫瘤組織中IDO高表達現象的觀點相符合，而亦有學者認為IDO在結腸癌原發灶與癌旁正常腸組織中的表達強度無明顯差異的觀點[11]，因此仍需擴大樣本量進一步研究。在60例大腸癌患者中，無轉移淋巴結中IDO高表達率為50.0%(13/26)，經分析與相應腫瘤原發灶(17/26)差異無統計學意義，說明在大腸癌細胞轉移至區域淋巴結前，區域淋巴結中IDO的高表達使局部色氨酸的分解增加、水平降低，而色氨酸作為T細胞活化增殖過程中的必須氨基酸導致T細胞的缺乏，從而使局部微環境處于免疫抑制狀態，為腫瘤的淋巴結轉移奠定了基礎；而在另一組34例伴有淋巴結轉移的患者中，IDO的表達強度明顯下降，其高表達率為35.3%,與相應原發灶(28/34)相比差異有統計學意義(P<0.05)。由此可推測，腫瘤區域淋巴結雖然通過高表達IDO來降解局部色氨酸，使之水平降低，但同時色氨酸作為一種必須氨基酸亦是腫瘤生長所必須的，因此腫瘤轉移至引流淋巴結后，IDO表達下調，降低了對色氨酸的分解，可能為轉移灶腫瘤的生長提供原料，從而參與腫瘤的轉移。

本研究通過對原發灶中IDO的高表達與患者臨床病理特征之間的關系進行分析，結果顯示，IDO的高表達N分期、Dukes分期、p53表達有關(P<0.05)。淋巴結轉移是大腸癌轉移的主要方式，在伴有淋巴結轉移、Dukes分期較晚的患者中，腫瘤IDO呈現高表達，提示IDO可能參與腫瘤的進展及轉移，可作為判斷大腸癌預后的一個指標。國內外學者在對于其他類型腫瘤的研究中也表明IDO的高表達與腫瘤患者預后差顯著相關[2]，并且多變量Cox回歸分析顯示IDO高表達為獨立的不良預后指標[12]。對于腫瘤患者IDO高表達與預后的關系，本題將繼續跟蹤調查研究。

p53抑癌基因位于人類第17號染色體的短臂，編碼一種相對分子質量為53 000的蛋白質(TP53)，是目前發現的與人類腫瘤關系最密切的基因，其突變是癌變發生、發展的重要原因[4-5]。p53分為野生型和突變型兩種，前者為抑癌基因，對細胞的分裂和增殖起負調控作用，但因半衰期較短不易被檢測到；而后者由于對細胞增殖的負調控作用減弱轉變為致癌基因，同時由于其編碼的p53蛋白半衰期較長，在細胞內穩定性增加，能被免疫組織化學法檢測，并且p53蛋白與突變型p53基因在組織中表達一致[4]。本研究分析大腸癌組織中IDO與p53表達的相關性，結果顯示兩者呈顯著的正相關，由此推測兩者可能共同參與大腸癌的發生、發展。此外，腫瘤局部微環境中免疫耐受形成過程較復雜，除IDO外，近年來研究表明，p53、血管內皮生長因子、EZH2、Ki67等多種因子或多種途徑參與大腸腫瘤細胞的侵襲和轉移[13-15]，但是它們之間的具體分子機制并不明確。腫瘤的侵襲和轉移是患者預后不佳的主要原因，而腫瘤微血管的形成在腫瘤的侵襲與轉移中起關鍵作用。2011年，劉俊田等[6]提出IDO可能通過促進腫瘤新生血管的形成來促進腫瘤的進展和轉移。

總之，IDO在大腸癌的發生、發展中起重要的作用，加強IDO的檢測對大腸癌的臨床診療有一定的參考意義。繼續對IDO在腫瘤局部微環境中具體分子機制的探討以及與血管形成、免疫等關系的進一步研究，可能對今后腫瘤新型治療策略的制訂具有更好的指導意義。

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摘要：目的分析大腸癌組織中吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)的表達及臨床意義。方法選擇2009年6月至2010年5月濱州醫學院附屬醫院經病理科診斷為大腸癌的成套石蠟組織標本60例，通過免疫組織化學法檢測IDO的表達情況，分析IDO的表達與臨床病理特征間的關系。結果IDO在大腸癌原發灶、癌旁正常組織、有淋巴結轉移灶及無淋巴結轉移淋巴結中的IDO高表達率分別為75.0%、18.3%、35.3%、50.0%。原發灶中IDO的表達強度與N分期、Dukes分期、p53表達有關(P<0.05)。Spearman相關性分析結果顯示，大腸癌原發灶中IDO和p53表達具有顯著的正相關性(rspan=0.352,P=0.006)。結論IDO在大腸癌組織中表達明顯上調，與腫瘤分期密切相關，可作為判斷大腸癌預后的一個指標。IDO和p53的表達關系密切，兩者可能共同參與大腸癌的發生、發展。

關鍵詞：大腸癌；吲哚胺2,3-雙加氧酶；p53

Study on IDO Expression in 60 Patients with Colorectal Cancer in Northern Shandong Region and Its Clinical SignificanceZHAOShuoa,WANGRong-huaa,LIBao-songa,FUTing-liangb,CUIYun-fua.(a.DepartmentofColorectalSurgery,b.DepartmentofPediatricSurgery,AffiliatedHospitalofBinzhouMedicalUniversity,Binzhou256600,China)

Abstract：ObjectiveTo analyze IDO expression in colorectal cancer and its clinical significance.MethodsThe complete sets of paraffin tissue samples of 60 patients diagnosed as colorectal cancer in Affiliated Hospital of Binzhou Medical College from Jun.2009 to May 2010 were collected,the IDO expressions of the cases were detected by immunohistochemical methods to analyze the relationship between IDO expression and clinical pathological features.ResultsThe high expression rates of IDO in primary lesion of colorectal tumor,normal tissue adjacent to tumor,lesion with lymph node metastasis and lesion without lymph node metastasis were 75.0%,18.3%,35.3% and 50.0%.IDO expression intensity in primary lesion of colorectal cancer is associated with N staging,Dukes staging,and p53 expression(P<0.05).Results of Spearman correlation analysis showed that the expression of IDO and p53 in primary lesion of colorectal cancer has a significant positive correlation(rspan=0.352,P=0.006).ConclusionIDO expression is significantly up-regulated in colorectal cancer,and closely related with tumor node metastasis,therefore,it can be used as an indicator to determine the prognosis of colorectal cancer.IDO expression and p53 expression are closely related,they may both be involved in the incidence and development of colorectal cancer.

Key words：Colorectal cancer; Indoleamine 2,3-dioxygenase; p53

收稿日期：2014-02-17修回日期：2014-06-24編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.06.078

中圖分類號:R735.34

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)06-1148-03