腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體對非小細胞肺癌細胞凋亡誘導的實驗研究

方呈祥,孫海燕,黃　強

(湖北民族學院附屬民大醫院 a.腫瘤科， b.放射科， c.肝膽外科，湖北 恩施 445000)

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體對非小細胞肺癌細胞凋亡誘導的實驗研究

方呈祥a,孫海燕b,黃強c※

(湖北民族學院附屬民大醫院 a.腫瘤科， b.放射科， c.肝膽外科，湖北 恩施 445000)

1995年，Wiley等[1]從人心肌DNA和外周血液淋巴細胞中分離獲得了腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)。TNF相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是近年來治療惡性腫瘤的研究熱點，目前尚無藥品問世，但實驗階段的研究已經證實了其不同形式的化合物結構所具有的抗腫瘤效果卓越。非小細胞肺癌作為一種人類重要的疾患，鮮有實驗報道重組人TRAIL (reorganization human TRAIL,rhTRAIL)對其的作用[2]。本研究對rhTRAIL誘導非小細胞肺癌腫小鼠瘤細胞凋亡情況進行觀察，以期為該類藥品的開發提供一定的實驗室資料。現將觀察結果報道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源小鼠非小細胞肺癌細胞為我實驗室保存，已經過鑒定。小鼠雌雄各15只，日齡為45～60 d，平均體質量(13.3±2.5) g，均由寧夏醫科大學試驗動物中心提供，許可證號：SCXY(寧)2005-0001。小鼠均體型小，成熟早，性情溫順。

1.1.2試劑試藥酶聯免疫吸附試驗試劑盒(生產批號：20080710)、干擾素α(interferon α，IFN-α)(生產批號：20020040)、TNF-α(生產批號：20140513)等均購于上海華大基因公司。

1.1.3儀器設備流式細胞儀(型號： FACSCalibur,廠家：美國 Becton Dicknson公司)，細胞培養系統(法國梅里埃公司,型號：sk631)。

1.2方法

1.2.1非小細胞癌細胞株Tc-1培養用添加雙抗的10%FBS DMEM培養液在5%二氧化碳飽和下37 ℃培養24 h，鏡下觀察細胞生長情況后收集細胞備用，細胞濃度為5×106個/L。

1.2.2小鼠接種非小細胞肺癌細胞將經過培養的Tc-1細胞按照1 mL/只接種體積接種于小鼠右上肢皮下，30只小鼠均接種，接種后的小鼠室溫下自由采食和飲水飼養。

1.2.3非小細胞肺癌小鼠分組小鼠生長5 d后，采用隨機數字表法將小鼠隨機分為6組，每組5只，分別標記為：空白對照組(磷酸鹽溶液)、不同劑量的rhTRAIL陽性實驗組(分別為1、2、4、5及10 mg/kg)。使6組小鼠在體質量、性別比例方面具有可比性。

1.2.4給藥方法陽性對照組按照既定的給藥劑量每天皮下注射rhTRAIL溶液，空白對照組每日皮下注射對應體積的磷酸鹽溶液，各組均連續注射15 d。

1.3觀察指標

1.3.1腫瘤體積連續給藥15 d后，對上述30只小鼠采用游標卡尺測量腫瘤最長最短直徑，計算腫瘤的體積。

1.3.2測定小鼠TNF-α、IFN-α水平測量腫瘤體積后處死小鼠，取小鼠脾臟，將每孔濃度為2×106的脾臟細胞于96孔圓底板中培養24 h后收集培養液離心，收取上清液，采用酶聯免疫吸附試驗試劑盒對培養液TNF-α、IFN-α水平進行檢測。

1.3.3腫瘤細胞凋亡率將上述離心的沉淀物用0.01 mol PBS溶液洗板后加入酸性磷酸酶底物檢測溶液，繼續培養120 min，將0.1 mol濃度的氫氧化鈉溶液加入每孔中，5 min后，采用酶標儀對各孔測定吸光度，測量波長為405 nm。腫瘤細胞凋亡率=(1-100×陽性對照不同濃度組吸光度/空白對照組吸光度)×100%。

2結果

2.1各組非小細胞肺癌小鼠腫瘤體積比較與空白對照組相比，5組陽性實驗組的腫瘤體積均值明顯小于空白對照組腫瘤體積，且隨著rhTRAIL濃度的增加，腫瘤體積減小的明顯(P<0.05)，見表1。

2.2各組非小細胞肺癌小鼠腫瘤細胞凋亡率比較5組陽性實驗組小鼠的Tc-1細胞凋亡率隨著rhTRAIL濃度增高，其凋亡率逐漸升高，濃度10 mg/kg高于濃度5 mg/kg，以此類推，凋亡率顯著提高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3各組非小細胞肺癌小鼠TNF-α、IFN-α水平比較5組陽性組小鼠的TNF-α、IFN-α水平均明顯高于空白對照組，濃度10 mg/kg高于濃度5 mg/kg，以此類推，TNF-α、IFN-α水平顯著提高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表1各組小鼠腫瘤體積比較

濃度只數體積0mg/kg6532±22 1mg/kg6446±17a2mg/kg6378±15a4mg/kg6333±14a5mg/kg6270±13a10mg/kg6222±11aF13.743P<0.05

a與0 mg/kg 比較，P<0.05

表2　各組小鼠腫瘤細胞凋亡率比較　±s,%)

a與0 mg/kg比較，P<0.05

濃度只數TNF-αIFN-α0mg/kg6439±20 385±20 1mg/kg6647±26a635±25a2mg/kg6769±34a780±38a4mg/kg6837±44a911±50a5mg/kg6873±46a965±47a10mg/kg6925±50a980±43aF15.34514.643P<0.05<0.05

TNF-α：腫瘤壞死因子α；IFN-α：干擾素α；a與0 mg/kg比較，P<0.05

3討論

人類細胞死亡信號系統中有TNF配體和相應的TNF細胞表面受體，人們由此推斷TNF和死亡信號系統中相關凋亡誘導配體之間存在密切的聯系，因此，TRAIL成為了腫瘤治療的一個研究熱點[2-3]。經過人們數十年的實驗研究，目前，各種TNF的不同形式在對抗腫瘤方面均取得了一定的進展，尤其是rhTRAIL，市面已經出現了相關的實驗試劑，個別國家已經進展到初期的臨床藥物試驗[4-5]。在不遠的將來， TRAIL類藥物將在人類和腫瘤進行的斗爭中發揮重要作用[6]。

研究表明，rhTRAIL可特異性地選擇腫瘤細胞進行誘導凋亡[7-8]，對正常細胞并不產生任何不良反應，這更客服了傳統腫瘤放化療時的巨大不良反應[9]。本研究也證實了這一點，因此，此類藥物在對抗腫瘤上具有廣闊的前景。

本研究結果顯示，rhTRAIL能有效控制非小細胞肺癌小鼠腫瘤生長，使腫瘤細胞發生一定的凋亡，凋亡率最高可達58.0%，平均凋亡率最高可達(46.7±6.8)%，增加其細胞分泌因子，提高該小鼠的免疫功能。在給藥劑量上，給藥濃度越高，其控制腫瘤生長和提高分泌細胞因子的作用越顯著。rhTRAIL經實驗證實可有效對抗非小細胞肺癌，但其最佳給藥劑量，尚需做進一步的研究，完善其毒理實驗，為后續臨床實驗提供一定的基礎資料。

參考文獻

[1]Wiley SR,Schooley K,Smolak PJ,etal.Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis[J].Immunity,1995,3(6):673-682.

[2]Jo M,Kim TH,Seol DW,etal.Apoptosis induced in normal human hepatocytes by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand[J].Nat Med,2000,6(5):564-567.

[3]楊芳,孫茂盛,易山,等.重組TRAIL腺病毒抑制肺癌細胞生長和誘導凋亡的作用[J].中國腫瘤生物治療雜志,2007,14(4):362-367.

[4]鄭中華,李蘊潛,郭敏,等.腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體對非小細胞肺癌細胞凋亡的誘導作用及其機制[J].吉林大學學報:醫學版,2013,39(1):16-18.

[5]施敏驊,余勇,錢斌,等.TRAIL和抗腫瘤藥物協同誘導非小細胞肺癌凋亡的實驗研究[J].蘇州大學學報:醫學版,2006,26(2):190-192,213.

[6]鄭中華,國巍,于洪泉,等.TRAIL聯合順鉑誘導非小細胞肺癌細胞凋亡的作用[J].中國老年學雜志,2012,32(24):5555-5556.

[7]鄧立力.過表達腫瘤抑制因子CYLD影響非小細胞肺癌TRAIL敏感性的實驗研究[D].哈爾濱：哈爾濱醫科大學,2011.

[8]王爽,齊玲,金宏,等.腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體聯合化療藥物對非小細胞肺癌細胞的作用機制研究[J].中國實驗診斷學,2011,15(6):1000-1001.

[9]王績英,王昌明,曾錦榮,等.腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體對肺癌細胞的殺傷作用研究[J].華中醫學雜志,2005,29(4):259-260,262.

摘要：目的觀察腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)對非小細胞肺癌小鼠模型腫瘤細胞凋亡誘導的作用。方法將小鼠非小細胞癌細胞株Tc-1于清潔小鼠右上肢皮下接種，共接種30只，每只接種濃度為5×106個Tc-1細胞。將上述小鼠按隨機數字表法分為6組(空白對照組和五種濃度rhTRAIL陽性實驗組)，各5只。空白對照組每天注射一次磷酸鹽溶液，陽性對照組每天注射不同濃度的重組人TRAIL(rhTRAIL)溶液，各組均連續注射15 d。對上述30只小鼠每2日測量腫瘤直徑計算腫瘤長短直徑，計算腫瘤體積。取小鼠脾臟細胞測定腫瘤壞死因子(TNF)α、干擾素(IFN)α水平。比較上述6組小鼠腫瘤體積、抑瘤率以及TNF-α、IFN-α水平。結果五組陽性對照組小鼠腫瘤體積明顯低于空白對照組[(446±17) mm3，(378±15) mm3，(333±14) mm3，(270±13) mm3，(222±11) mm3比(532±22) mm3，P<0.05]；5組陽性對照組隨著rhTRAIL濃度的增加，腫瘤體積相應減小；五組陽性組小鼠的Tc-1細胞凋亡率隨著rhTRAIL濃度增高，其凋亡率逐漸升高；5組陽性組小鼠的TNF-α、IFN-α水平均明顯高于空白對照組[(647±26) ng/L、(769±34) ng/L、(837±44) ng/L、(873±46) ng/L、(925±50) ng/L比(439±20) ng/L，P<0.05;(635±25) ng/L、(780±38) ng/L、(911±50) ng/L、(965±47) ng/L、(980±43) ng/L比(385±20) ng/L，P<0.05]。結論rhTRAIL能有效增強非小細胞肺癌小鼠體內的分泌細胞因子，有效誘導非小細胞肺癌小鼠的腫瘤細胞凋亡，說明rhTRAIL對非小細胞肺癌小鼠的腫瘤細胞具有一定的抑制作用。

關鍵詞：重組腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體；非小細胞肺癌小鼠；誘導；腫瘤細胞凋亡

Experimental Study of Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-inducing Ligand Inducing Non-small Cell Lung Cancer Cell ApoptosisFANGCheng-xianga,SUNHai-yanb,HUANGQiangc.(a.DepartmentofOncology,b.DepartmentofRadiology,c.DepartmentofHepatobiliarySurgery,UniversityHospitalofHubeiUniversityforNationalites,Enshi445000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the tumor cell inducing effect of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) in non-small cell lung cancer mouse models.MethodsNon-small cell carcinoma cell line Tc-1 were inoculated subcutaneously in the right upper limb of 30 mice,5×106Tc-1 cells each inoculum.The above mice were randomly divided into six groups(control group,and rhTRAIL positive groups of five concentrations),five in each group.The blank control group was injected phosphate solution once every day,the positive control groups were injected rhTRAIL solution of different concentrations continuously for 15 d. Tumor diameter of the above mice were measured and recorded every 2 d,and the tumor volumes were calculated.Tumor necrosis factor α (TNF-α),interferon α(IFN-α) concentrations from the spleen cells of the mice were measured.The tumor volume,tumor inhibition rate,and TNF-α,IFN-α concentrations of the six groups were compared.ResultsThe tumor volume of the five positive groups were statistically significantly lower than the blank control group [(446±17) mm3,(378±15) mm3,(333±14) mm3,(270±13) mm3,(222±11) mm3vs (532±22) mm3,P<0.05];with the increase of rhTRAIL concentration,the tumor volume of the five positive groups reduced accordingly;Tc 1 cell apoptosis rate in mice increased with the increase of rhTRAIL concentration; TNF-α,IFN-α concentration in mice of the five positive groups were significantly higher than the blank control group[(647±26) ng/L,(769±34) ng/L, (837±44) ng/L,(873±46) ng/L,(925±50) ng/L vs (439±20) ng/L,P<0.05;(635±25) ng/L,(780±38)ng/L,(911±50) ng/L,(965±47) ng/L,(980±43) ng/L vs (385±20) ng/L,P<0.05].ConclusionrhTRAIL can effectively enhance cytokines secretion of the non-small cell lung cancer in mice,induce apoptosis of the tumor cells,indicating rhTRAIL has a certain inhibitory effect for non-small cell lung cancer cells in mice.

Key words:Recombinant tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand; Non-small cell lung cancer in mice; Induction; Tumor cell apoptosis

收稿日期：2014-11-28修回日期：2015-04-29編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.16.063

中圖分類號:R979.1； Q279

文獻標識碼:A

文章編號：1006-2084(2015)16-3050-03