慢性淺表性胃炎不同證型大鼠琥珀酸脫氫酶活性與細(xì)胞色素C含量對(duì)比研究

王麗　李翌萌

慢性淺表性胃炎不同證型大鼠琥珀酸脫氫酶活性與細(xì)胞色素C含量對(duì)比研究

王麗李翌萌

【摘要】目的探討慢性淺表性胃炎(chronic superficial gastritis, CSG)脾虛與濕熱證模型大鼠胃組織琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)的活性及細(xì)胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)的含量變化，從能量代謝的角度揭示CSG不同證候的實(shí)質(zhì)。方法用水楊酸鈉溶液灌胃法復(fù)制大鼠單純CSG模型，在此基礎(chǔ)上，用小承氣湯瀉下法及饑飽失常法復(fù)制脾虛CSG模型；用肥甘辛辣飲食法復(fù)制濕熱CSG模型，5周后，檢測(cè)大鼠胃組織琥珀酸脫氫酶活性及細(xì)胞色素C含量。結(jié)果SDH的含量為：濕熱CSG組最高，而脾虛CSG組最低。脾虛CSG組與濕熱CSG組分別與其他組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；胞漿中Cyt-C含量造模組均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，其中脾虛CSG組最高，濕熱CSG組次之，兩組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論CSG不同證型大鼠胃組織SDH活性及Cyt-C含量的差異，提示同一疾病不同證型之間能量代謝狀態(tài)的不同，濕熱證相對(duì)于脾虛證能量代謝較亢進(jìn)。

【關(guān)鍵詞】濕熱證；脾虛證；琥珀酸脫氫酶；細(xì)胞色素C；慢性淺表性胃炎

慢性淺表性胃炎(chronic superficial gastritis, CSG)為消化系統(tǒng)的一種常見(jiàn)病，指胃黏膜呈慢性淺表性炎癥改變。有研究[1]發(fā)現(xiàn)，脾虛證和濕熱證是其較多見(jiàn)的證型。琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogen-ase,SDH)是三羧酸循環(huán)中的一個(gè)重要的酶，在生物體內(nèi)，能催化琥珀酸脫氫轉(zhuǎn)變成延胡索酸，同時(shí)釋放出大量能量供機(jī)體利用。相關(guān)研究[2]得出結(jié)論，SDH活性高低與細(xì)胞有氧代謝呈正相關(guān)。細(xì)胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)是線粒體呼吸鏈中傳遞電子的載體，研究[3]指出，如果Cyt-C功能障礙，則會(huì)引起線粒體呼吸鏈功能異常，導(dǎo)致ATP缺失，出現(xiàn)細(xì)胞死亡。本研究通過(guò)復(fù)制慢性淺表性胃炎大鼠脾虛證和濕熱證模型，檢測(cè)大鼠胃組織SDH活性及胞漿中細(xì)胞色素C的含量，以期從能量代謝的角度探討CSG脾虛證及濕熱證的實(shí)質(zhì)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只清潔級(jí)SD大鼠[合格證號(hào)：SCXK(京)2007-0001]，體質(zhì)量(170±20)g，雌雄各半。

1.2分組與造模

參考文獻(xiàn)[4-6]進(jìn)行造模。40只大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法選出10只，每天灌胃2 mL生理鹽水，持續(xù)5周，此為正常對(duì)照組；另30只每天灌胃5%水楊酸鈉溶液10 mL/kg·d，3周后，用隨機(jī)數(shù)字表法將其平均分為以下三組：?jiǎn)渭僀SG組、脾虛CSG組和濕熱CSG組。此三組繼續(xù)按體重灌胃5%水楊酸鈉溶液，在此基礎(chǔ)上，脾虛CSG組另予小承氣湯10 mL/kg·d灌胃，隔日半量飲食，自由飲水；濕熱CSG組大鼠可自由飲用200 g/L的蜂蜜水，隔日交替灌服10 mL/kg·d的白酒與油脂；而單純CSG組不加其他因素，2周后，造模結(jié)束。此造模過(guò)程共持續(xù)5周，3只大鼠由于灌胃不慎等原因死亡。

1.3主要試劑

SDH試劑盒(批號(hào)：20101207)、考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20101207)、大鼠Cyt-C定量檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20101207)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4主要儀器

anthos 2010全自動(dòng)酶標(biāo)儀(奧地利安圖公司)，TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；勻漿器；BX51 Olympus 熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；精密移液器；SHA-B恒溫振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司)；

1.5指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1琥珀酸脫氫酶(SDH)檢測(cè)大鼠處死后剖開(kāi)腹腔，稱量一定量的胃組織，加9倍生理鹽水，制成10%的勻漿，2500 r/min離心10分鐘后，按試劑盒說(shuō)明方法取上清液進(jìn)行SDH活性檢測(cè)。

1.5.2細(xì)胞色素C(Cyt-C)檢測(cè)將準(zhǔn)確稱量的胃組織按重量體積比加入4倍的生理鹽水，制成20%的勻漿，2500 r/min離心10 分鐘后棄沉淀, 取上清液，再以10000 r/min低溫離心15 分鐘, 取上清液，上清液為胞漿，采用雙抗體兩步法夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行Cyt-C含量的測(cè)定。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1大鼠胃組織SDH活性變化比較

大鼠胃組織SDH活性比較：濕熱CSG組最高，而脾虛CSG組最低。各組數(shù)值經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差齊，說(shuō)明組間有差異，用LSD法進(jìn)行組間比較，得出以下結(jié)果：脾虛CSG組分別與其它三組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；濕熱CSG組分別與其他三組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；正常組與單純CSG組比較，差異未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

組別nSDH(U/mgprot)Cyt-C(nmol/L)正常組102.24±0.50ac62.57±7.01c單純CSG組101.84±0.22bc71.87±5.9cd濕熱CSG組82.84±0.48c74.93±8.97ce脾虛CSG組91.12±0.56b86.43±3.58

注：與濕熱CSG組比較，aP<0.05，bP<0.01；與脾虛CSG組比較，cP<0.01；與正常組比較，dP<0.05，eP<0.01

2.2各組大鼠胃組織Cyt-C含量變化比較

大鼠胃組織胞漿中Cyt-C含量比較：造模三組均高于正常對(duì)照組。其中，濕熱CSG組最高，脾虛CSG組次之，各組經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差齊，說(shuō)明總體有差異，采用LSD法進(jìn)行多組間比較，得出以下結(jié)果：脾虛CSG組分別與其他三組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；正常組分別與單純CSG組及濕熱CSG組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；濕熱CSG組與單純CSG組比較，差異未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

3討論

SDH是線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶，為線粒體的一種標(biāo)志酶，可為真核細(xì)胞線粒體和多種原核細(xì)胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，SDH的活性增高，標(biāo)志著細(xì)胞內(nèi)能量即ATP生成增強(qiáng)[7]。

實(shí)驗(yàn)中濕熱CSG組大鼠胃組織SDH活性增強(qiáng)，提示機(jī)體能量生成增加，究其原因有可能與熱證時(shí)細(xì)胞線粒體氧化磷酸化功能亢進(jìn)有關(guān)。有研究[8]通過(guò)復(fù)制大鼠實(shí)熱證、虛熱證模型，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞線粒體呼吸鏈SDH活力升高，后經(jīng)清熱中藥干預(yù)2周后，SDH活力有所恢復(fù)，提示熱證與機(jī)體能量代謝的正相關(guān)性。

實(shí)驗(yàn)中脾虛CSG組大鼠胃組織SDH活性明顯低于其他三組，其活性下降原因可能因?yàn)闄C(jī)體處于正氣不足的虛證狀態(tài)，組織細(xì)胞代謝低下，而SDH活性亦隨著線粒體功能下降而降低。相關(guān)研究[9]用大黃復(fù)制大鼠脾虛模型，發(fā)現(xiàn)SDH含量明顯降低，與本研究結(jié)果相一致。

Cyt-C是生物氧化呼吸鏈中重要的電子傳遞體，供應(yīng)細(xì)胞能量。正常情況下，位于線粒體內(nèi)、外膜之間，不能透過(guò)外膜。但當(dāng)組織缺氧等致細(xì)胞膜通透性增高時(shí)，細(xì)胞色素C可以穿過(guò)外膜[10]，進(jìn)入到胞漿中。亦有研究[11]表明在長(zhǎng)期脾虛狀態(tài)下，各器官線粒體DNA受到損害，機(jī)體能量代謝相應(yīng)減少。通過(guò)本研究可知：脾虛組大鼠的胃細(xì)胞胞漿內(nèi)Cyt-C含量最高，由此推測(cè)可能是由于脾虛，正氣不足，線粒體呼吸鏈功能異常，ATP缺乏，能量產(chǎn)生不足，細(xì)胞功能下降，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性相對(duì)增高，Cyt-C透過(guò)線粒體外膜進(jìn)入胞漿，出現(xiàn)胞漿內(nèi)Cyt-C含量增高的變化。

本研究顯示濕熱CSG組大鼠Cyt-C含量高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但不及脾虛CSG組(P<0.01)，與單純CSG組比較差異未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，關(guān)于濕熱證大鼠細(xì)胞色素C活性研究的相關(guān)報(bào)道較少，尚未查到，其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步探討，亦不排除本研究由于樣本含量、造模方法、實(shí)驗(yàn)手段、操作流程等出現(xiàn)的偏倚所致。

相關(guān)研究[6]指出，大鼠脾虛狀態(tài)下肝臟線粒體琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶活性均顯著降低，說(shuō)明線粒體受損，能量代謝出現(xiàn)障礙。本研究亦發(fā)現(xiàn)，SDH活性及Cyt-C含量在濕熱CSG組及脾虛CSG組大鼠中存在差異，由此可推斷病同證不同，則其分子生物學(xué)指標(biāo)出現(xiàn)差異，這可能是證在微觀指標(biāo)上的體現(xiàn)。關(guān)于細(xì)胞色素C的釋放途徑、發(fā)生機(jī)制等，尚待進(jìn)一步探討。

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(本文編輯：蒲曉田)

·論著·

作者單位：210002 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科

Contrast of succinate dehydrogenase vitality and cytochrome C content in rats of different syndromes of chronic superficial gastritisWANGLi,LIYi-meng.NursingCollegeofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the mechanisms of different syndromes in terms of the energy metabolism by observing the activity changes of succinate dehydrogenase (SDH)and the content changes of cytochrome C (Cyt-C) in rats with chronic superficial gastritis (CSG) of spleen-deficiency syndrome and damp-heat syndrome. MethodsCSG rat model was established by the intragastric administration of sodium salicylate solution. CSG rat model with spleen-deficiency syndrome was established by Xiaochengqi Decoction-induced purgation and eating disorders. CSG rat model with damp-heat syndrome was established by feeding fat, sweet and spicy diet. Five weeks later, SDH activity and Cyt-C content of gastric tissue were determined. ResultsThe activity of SDH in damp-heat CSG group was the highest of all, but which in spleen-deficiency CSG group was the lowest . The activity of SDH was obviously changed in damp-heat CSG group also in spleen-deficiency CSG group in comparison with the other three groups, respectively.(P<0.05 or P<0.01). The content of Cyt-C in the three model groups was higher than which in normal group(P<0.05 or P<0.01). The content of Cyt-C in spleen-deficiency CSG group was the highest of all, with the damp-heat CSG group secondarily. There was a significantly content difference between the two groups (P<0.01) . ConclusionThe difference in the SDH activity and Cyt-C content of CSG rat with different syndromes , revealed the different energy metabolism of different syndromes for the same disease, the energy metabolism of damp-heat symdrome was higher than which of spleen-deficiency syndrome.

【Key words】Damp-heat syndrome;Spleen-deficiency syndrome;Succinate dehydrogenase;Chronic superficial gastritis

作者簡(jiǎn)介：趙凌杰(1966- )，女，博士，副主任醫(yī)師，研究生導(dǎo)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療風(fēng)濕免疫。E-mail：zhaolingjie68@163.com

基金項(xiàng)目：南京軍區(qū)南京總醫(yī)院科研基金(2013056)

(收稿日期：2014-03-08)

Corresponding author:WANG Li,E-mail: wltcm@126.com

【中圖分類號(hào)】R573.3+1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1674-1749.2015.03.012