胰腺癌細胞與其基質成纖維細胞相互影響的研究

蘇嬌嬌，馮 慧，姚瑋艷，陳 熹，張辰宇，王亞雷

胰腺癌細胞與其基質成纖維細胞相互影響的研究

蘇嬌嬌1，馮 慧1，姚瑋艷2，陳 熹3，張辰宇3，王亞雷1

摘要目的 觀察胰腺癌細胞系BXPC-3、SW1990能否促進其基質中正常成纖維細胞（NFs）活化成癌相關成纖維細胞（CAFs）及其活化的可能機制，以及活化后的CAFs對BXPC-3、SW1990細胞遷移能力的影響。方法 采用差異貼壁法分選出野生型小鼠C57胰腺組織中的NFs，后運用非接觸式共培養方法將BXPC-3、SW1990與NFs共培養，共培養后采用免疫熒光方法檢測共培養前后NFs中CAFs標志性蛋白α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、成纖維細胞活化蛋白（FAP）的表達變化，以確定其是否活化，并且運用qRT-PCR法檢測目前較公認的胰腺癌中升高的12種miRNAs在共培養前后的NFs中含量變化；采用transwell法觀察活化前后的NFs對BXPC-3、SW1990遷移能力的影響。結果 免疫熒光檢測表明，與BXPC-3、SW1990共培養后，NFs中α-SMA、FAP表達均顯著升高；同時，在所選取的12種miRNAs中，與BXPC-3、SW1990共培養后，NFs中miR-155含量均有明顯升高。BXPC-3、SW1990在CAFs基質環境中遷移能力大大提高。結論 胰腺癌細胞能夠促進其周圍NFs活化成CAFs，其活化可能與胰腺癌中某些特定的miRNA分泌進入到NFs中有關，活化后的CAFs又可以反過來促進胰腺癌細胞的遷移。

關鍵詞胰腺癌；癌相關成纖維細胞；miRNAs；遷移

2015－01－02接收

作者單位：1安徽醫科大學第一附屬醫院消化內科，合肥 2300222上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院消化內科，上海200025

3江蘇省小核糖核酸工程研究中心，南京大學生命科學學院，南京 210000

近年來研究［1－2］顯示腫瘤的發生發展與由多種基質細胞、細胞因子、趨化因子等組成的腫瘤微環境密切相關，其中基質細胞中的癌相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）越來越受到關注。胰腺癌作為臨床上惡性程度極高的腫瘤，總體5年生存率低于5%，其病因和發病機制目前尚未完全闡明，針對胰腺癌細胞本身的治療也療效欠佳［3－4］。目前對胰腺癌中CAFs的產生機制以及CAFs對胰腺癌細胞的影響尚不完全清楚，該研究擬通過胰腺癌細胞系與正常成纖維細胞（normal fibroblasts，NFs）共培養構建CAFs模型初步研究其產生機制以及其對胰腺癌細胞系生物學行為的影響。

1 材料與方法

1．1 細胞與試劑 野生型C57小鼠由南京大學生命科學學院動物房提供；人胰腺癌細胞系BXPC-3、SW1990購自上海細胞生物學研究所；高糖DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；膠原酶購自美國Sigma公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）一抗、成纖維細胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）一抗、熒光二抗和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚［2-（4-Amidinophenyl）-6-indolecarbamidine dihydrochloride，DAPI］均購自英國Abcam公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；TaqMan microRNA探針、AMV酶等試劑均購自美國TaKaRa公司；共培養小室購自德國Merckmillipore公司。

1．2 原代細胞培養 提取10周大小正常野生型C57小鼠胰腺組織，用D-Hank液沖洗新鮮胰腺組織，并將組織剪成2～3 cm2碎塊后置于膠原酶中，37℃消化20 min，然后加入等體積含10%DMEM培養基終止消化。1 000 r／min離心5 min，棄上清液，重懸后置于15%FBS DMEM＋1%雙抗培養基、37℃、5% CO2條件下培養。采用差異貼壁法分選出NFs，將分選出的NFs的第2～5代細胞用于實驗。

1．3 細胞共培養 胰腺癌細胞系與NFs用胰酶消化，1 000 r／min離心5 min，用3 ml DMEM培養基重懸。選取1 ml重懸液，再將其稀釋20倍，將稀釋后的細胞混懸液充分混勻，選取10 μl重懸液放于細胞計數板下計數。最后將BXPC-3、SW1990與NFs分別按3∶1的細胞數比例鋪于0.4 μm孔徑的共培養小室中。上室放BXPC-3或SW1990細胞（各自約1.2×105個），下室放NF細胞（約0.4×105個），將共培養小室置于細胞培養6孔板中；共培養時，上

室用含10%血清DMEM培養基，下室用含15%血清DMEM培養基；在上述環境中將細胞共培養4～5 d，每1～2 d換液1次，每次換液時上下室同時更換培養基；所用培養基同前，共培養結束后，撤去上室，用倒置顯微鏡觀察下室的NFs，拍照觀察比較共培養前后的NFs形態變化，并將細胞用于以后實驗。

1．4 免疫熒光方法檢測蛋白含量 用4%多聚甲醛固定NFs 20 min，PBS洗滌后，用0．5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）通透細胞膜30 min；室溫封閉1 h后，分別孵育α-SMA一抗，FAP一抗4℃過夜，在避光條件下孵育熒光二抗1 h；PBS洗滌后用DAPI染核5 min。細胞處理結束后在熒光顯微鏡下拍攝被α-SMA、FAP標記的細胞視野，然后變換熒光通道；拍攝相同視野下被DAPI染出的細胞核形態，最后運用olympusmicro軟件將拍出的兩張圖片合并（即將上述兩張圖進行Merge處理）；最終計算顯微鏡視野中所見的被α-SMA或FAP蛋白標記的細胞數占總細胞數的比例（顯微鏡下選取最具代表性的5個視野作為統計依據），以此初步評估NFs是否被活化成CAFs。

1．5 qRT-PCR法檢測共培養前后NFs中特定miRNA含量變化 根據文獻［12］，選取miR-20a、miR-21、miR-24、miR-25、miR-31、miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-181b、miR-196a、miR-221、miR-375等12種miRNAs，檢測培養前后NFs中上述miRNA含量變化。用TRIzol Reagent試劑提取NFs中的RNA，用1 μg RNA進行逆轉錄；逆轉錄在200 μl離心管中進行，為10 μl體系，反應條件為16℃30 min，42℃30min，85℃5 min。運用TaqMan PCR試劑盒在PCR反應條件下通過ABI Prism 7300 SDS系統進行PCR反應，所用的miRNA探針由美國TaKaRa公司合成。具體條件為95℃5 min，95 ℃15 s連續40個循環反應，60℃1 min；利用ABI Prism 7300 SDS軟件V1．3．1進行數據分析，并運用U6作為內參，ΔΔCt＝（Ct miRNA-Ct U6）（共培養后）－（Ct miRNA-Ct U6）（共培養前）。

1．6 細胞遷移功能實驗 將胰腺癌細胞系BXPC-3 或SW1990（各自約3×104個／小室）放于8 μm孔徑的經過fibronectin包被的transwell小室的上室中，下室為活化的CAFs，以NFs作為陰性對照。上下室細胞均在含10%血清的DMEM培養基孵育約12 h，取出上室；用4%多聚甲醛固定細胞20 min，用0．1%結晶紫染色15 min，在水中輕柔的用棉簽擦去上室內的細胞，后將小室倒置，風干，分別計數附著在膜的下室側而不會掉到下室里的細胞，以此判斷癌細胞在不同基質環境中的遷移能力。

1．7 統計學處理 采用SPSS 17．0軟件進行分析，組間差異的比較采用單因素方差分析。

2 結果

2．1 NFs形態觀察 采用差異貼壁法分選出小鼠胰腺組織中的NFs，可見NFs外觀呈梭形，胞體大，達一定密度時在倒置顯微鏡下可見細胞在培養瓶底部形成漩渦狀改變。見圖1A。

2．2 CAFs檢測

2．2．1 CAFs形態觀察 將胰腺癌細胞與NFs共培養4～5 d后，在倒置顯微鏡下觀察CAFs形態亦呈梭形，外觀與NFs無明顯區別。見圖1B。

2．2．2 共培養后α-SMA、FAP蛋白表達水平變化免疫熒光方法檢測顯示，與陰性對照相比，NFs與BXPC-3細胞共培養之后，其α-SMA表達量上升了（3.08±0.48）倍（F＝12.61，P＜0.05），FAP蛋白表達量上升了（2.74±0.420）倍（F＝9.86，P＜0.05）；與SW1990細胞共培養后，NFs中α-SMA表達量上升了（2.05±0.47）倍（F＝10.89，P＜0.05），FAP蛋白表達量上升了（2.46±0.08）倍（F＝8.89，P＜0.05）。提示共培養之后的NFs被活化成CAFs。見圖2。

2．2．3 共培養前后NFs中某些特定miRNA含量變化 qRT-PCR法檢測發現，在胰腺癌普遍認為升高的12種miRNAs中，NFs與BXPC-3細胞共培養后其中miR-155含量升高了（1.50±0.45）倍（F＝9.85，P＜0.05），與SW1990細胞共培養之后其中miR-155含量升高了（1.95±0.65）倍（F＝8.26，P ＜0.05）。提示在胰腺癌周圍NFs活化過程中，miR-155可能從胰腺癌細胞中分泌到其周圍NFs中，并發揮了促進活化的作用。見圖3。

2．3 CAFs對胰腺癌細胞遷移能力的影響 transwell實驗表明，與陰性對照相比，BXPC-3、SW1990細胞在CAFs基質中遷移能力分別上升了（80.28± 0.27）%、（75.28±0.22）%，差異有統計學意義（F ＝5.87、4.66，P＜0.01）。見圖4。

3 討論

近年來研究［5］顯示，腫瘤細胞與腫瘤微環境類似于“種子”與“土壤”的關系，即腫瘤微環境可以為腫瘤細胞提供良好的“土壤”，促進“種子”（腫瘤細胞）的生長。腫瘤微環境中含有CAFs、內皮細胞、內分泌細胞、免疫細胞等多種細胞，可以分泌各種細胞因子、趨化因子等，從而影響癌細胞的遷移、血管生成、增殖、免疫認知等功能，促進腫瘤的發生發展和轉移［6］。

在胰腺癌中，基質細胞占了腫瘤體積的90%，CAFs占據了大部分的基質成分［2］。但是，目前對于胰腺癌與癌旁基質之間相互影響的內在機制尚不清楚，且當前主要的研究［7］均集中于已活化的CAFs

引起胰腺癌的發生發展。對于胰腺癌中CAFs從何而來，通過何種途徑轉化而來，目前知之甚少。這也限制了通過干擾胰腺癌-癌旁基質的相互作用進而抑制胰腺癌發展的研究。

CAFs是實質腫瘤間質中數量最豐富的細胞類型，可以釋放表皮生長因子、轉化生長因子β及趨化因子，促進腫瘤細胞表現出各種惡性生物學行為［8］。該研究將提取的NFs與胰腺癌細胞共培養，發現共培養之后的NFs中α-SMA、FAP蛋白含量顯著升高。有研究［6，9］顯示α-SMA、FAP蛋白在控制成纖維細胞生長及胚胎發育組織修復和上皮性腫瘤的演進過程中可能起一定的作用，且在CAFs中含量明顯升高，是比較公認的CAFs標志性蛋白，結合該研究結果顯示，在共培養之后，NFs被活化為CAFs。目前認為CAFs的來源主要有：①NFs被激活后演變而來；②骨髓間充質干細胞經歷某些刺激后轉化而來；③腫瘤細胞經歷上皮至間葉細胞轉化的過程中產生。其中NFs被激活被認為是其主要來源［6，10］，該研究也證實了這一點。

miRNA是一種非蛋白質編碼的RNA，它通過與靶mRNA的3′-UTR結合，降解或者抑制mRNA的翻譯導致靶基因轉錄后靜默，從而參與靶基因功能的調節。目前研究［11］顯示miRNA不僅僅存在于細胞中，還可能通過某種特定方式分泌到體液循環中，并且進入另一種細胞中發揮作用。該研究對共培養前后NFs中miRNA的含量變化進行了初步的研究。該研究根據既往文獻［12］的報道，選取了在胰腺癌組織中升高明顯的miR-155、miR-221、miR-375等12 種miRNAs，檢測在共培養前后NFs中這些miRNAs含量的變化，結果顯示miR-155含量在共培養之后明顯升高，提示miR-155可能通過某種特殊方式從胰腺癌細胞進入基質成纖維細胞，并且在其中發揮一定作用促進NFs活化。

該研究將胰腺癌細胞系在不同基質環境（即NFs、CAFs）中進行transwell實驗，發現在CAFs基質環境中胰腺癌細胞的遷移能力顯著增強。這與目前大部分的腫瘤研究［7］結果類似，進一步證實了CAFs在胰腺癌發生發展中的作用。有研究［13］顯示在卵巢癌中被激活的CAFs可以通過分泌肝細胞生長因子等細胞因子促進腫瘤細胞的侵襲能力。在胰腺CAFs對癌細胞的影響過程中有哪些因素參與其中，有待進一步研究。

綜上所述，該研究反映了胰腺癌細胞與基質細胞之間存在交互作用，互相影響，互相促進，從而導致了胰腺癌細胞的發生和發展。

參考文獻

［1］ Kharaishvili G，Simkova D，Bouchalova K，et al．The role of cancerassociated fibroblasts，solid stress and other microenvironmental factors in tumor progression and therapy resistance［J］．Cancer Cell Int，2014，14：41

［2］ Luo G，Long J，Zhang B，et al．Stroma and pancreatic ductal adenocarcinoma：an interaction loop［J］．Biochim Biophys Acta，2012，1826（1）：170－8．

［3］ Goicoechea S M，García-Mata R，Staub J，et al．Palladin promotes invasion of pancreatic cancer cells by enhancing invadopodia formation in cancer-associated fibroblasts［J］．Oncogene，2014，33（10）：1265－73．

［4］ Stromnes I M，DelGiorno K E，Greenberg P D，et al．Stromal reengineering to treat pancreas cancer［J］．Carcinogenesis，2014，35 （7）：1451－60．

［5］ Su S，Liu Q，Chen J，et al．A positive feedback loop between mesenchymal-like cancer cells and macrophages is essential to breast cancer metastasis［J］．Cancer Cell，2014，25（5）：605－20．

［6］ Mao Y，Keller E T，Garfield D H，et al．Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer［J］．Cancer Metastasis Rev，2013，32（1－2）：303－15．

［7］ Hwang R F，Moore T，Arumugam T，et al．Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression［J］．Cancer Res，2008，68（3）：918－26．

［8］ Allen M，Louise Jones J．Jekyll and Hyde：the role of the microenvironment on the progression of cancer［J］．J Pathol，2011，223 （2）：162－76．

［9］ Hawinkels L J，Paauwe M，Verspaget H W，et al．Interaction with colon cancer cells hyperactivates TGF-β signaling in cancer-associated fibroblasts［J］．Oncogene，2014，33（1）：97－107．

［10］Farrow B，Sugiyama Y，Chen A，et al．Inflammatory mechanisms contributing to pancreatic cancer development［J］．Ann Surg，2004，239（6）：763－71．

［11］Zhang Y，Liu D，Chen X，et al．Secreted monocytic miR-150 enhances targeted endothelial cell migration［J］．Mol Cell，2010，39 （1）：133－44．

［12］Wan C，Shen Y，Yang T，et al．Diagnostic value of microRNA for pancreatic cancer：a meta-analysis［J］．Arch Med Sci，2012，8 （5）：749－55．

［13］Cai J，Tang H，Xu L，et al．Fibroblasts in omentum activated by tumor cells promote ovarian cancer growth，adhesion and invasiveness［J］．Carcinogenesis，2012，33（1）：20－9．

The interaction between pancreatic cancer cells and fibroblasts

Su Jiaojiao1，Feng Hui1，Yao Weiyan2，et al
（1Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Gastroenterology，Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200025）

AbstractObjective To investigate whether the pancreatic cancer cells BXPC-3，SW1990 can activate normal fibroblasts（NFs）into cancer-associated fibroblasts（CAFs）and the possible mechanism and whether CAFs can motivate the migration of the cancer cells．Methods NFs were isolated from mouse pancreas tissues of wild C57，then NFs were cultured with BXPC-3 or SW1990 cells by indirect co-cultures，and detected the content of the specific proteins α-SMA，FAP in fibroblasts by immunofluorescence assay，then detected the content of the 12 different kinds of miRNAs in fibroblasts which were regarded as overexpressed in pancreatic cancer by qRT-PCR，and estimated the effect of the different fibroblasts（NFs，CAFs）on cancer cell migration by transwell．Results After cocultered with BXPC-3 or SW1990 cells，the α-SMA and FAP level in fibroblasts increased dramatically．Among the selected 12 kinds of miRNAs，after cocultered with BXPC-3 or SW1990 cells，the content of miR-155 in fibroblasts raised significantly．The migration of BXPC-3，SW1990 cells increased dramatically in the environment of CAFs compared with the environment of NFs．Conclusion BXPC-3 or SW1990 cells can activate NFs into CAFs，and miRNAs may play an important role in the process，then CAFs can reversely motivate the migration of BXPC-3 or SW1990 cells．

Key wordspancreatic cancer；cancer-associated fibroblasts；miRNAs；transwell

作者簡介：蘇嬌嬌，女，碩士研究生；王亞雷，男，副教授，副主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：alei416＠163．com

基金項目：國家自然科學基金（編號：81101849／H1617）

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0427－05

中圖分類號R 735．9