PRMT2及其剪接體在乳腺癌MCF-7細胞中的亞細胞定位及意義

陳亞軍，鐘 警，楊 靖，文格波

PRMT2及其剪接體在乳腺癌MCF-7細胞中的亞細胞定位及意義

陳亞軍1，2，3，鐘 警1，楊 靖1，文格波1

摘要目的 構建蛋白質精氨酸甲基轉移酶2（PRMT2）及其差異剪接體與綠色熒光蛋白（GFP）的真核表達載體，轉染后觀察其融合蛋白在乳腺癌MCF-7細胞中的表達及亞細胞定位，為進一步研究PRMT2基因及其新的差異剪接體在乳腺癌中的作用奠定基礎。方法 以pGEM-T-PRMT2／α／β／γ載體為模板，設計引物，PCR擴增目的基因，并將PCR產物克隆至pcDNA3．1／NT-GFP-topo載體，轉化后將陽性克隆擴增，對PCR產物進行跑膠鑒定和測序。提取pcDNA3．1／NT-GFP-PRMT2／α／β／γ及空載體pcDNA3．1／NT-GFP質粒，用脂質體介導轉染MCF-7細胞，在激光共聚焦顯微鏡下，觀察外源性PRMT2／α／β／γ融合蛋白在MCF-7細胞中的亞細胞定位。采用Western blot法檢測各重組融合蛋白在MCF-7細胞中的表達。結果 各GFP在細胞中均有表達，但其在細胞中的分布位置不一致。PRMT2α與PRMT2γ的融合蛋白同PRMT2的分布一致，均聚集于核仁外的核漿，胞質中有少許分布；而PRMT2β和空載體的熒光蛋白的分布一致，都均勻分布于細胞的胞質和胞核，包括核仁部分。Western blot法檢測表明各重組融合蛋白在MCF-7細胞中均有表達。結論 PRMT2及其各剪接體的亞細胞定位不同，可能提示其在功能方面存在差異。

關鍵詞乳腺癌；蛋白質精氨酸甲基轉移酶2；剪接體；亞細胞定位

2015－01－13接收

作者單位：1南華大學附屬第一醫院臨床醫學研究所，衡陽 421001

2南華大學附屬第二醫院內分泌科，衡陽 4210013南華大學病理生理學教研室，衡陽 421001

乳腺癌是嚴重危害女性健康的惡性腫瘤，近年來其發病率在我國呈逐年上升趨勢［1］。在影響乳腺癌發生、發展和預后的諸多因素中，雌激素起著重要的作用，雌激素能與雌激素受體（estrogen receptor，ER）結合，激活含雌激素反應元件基因的表達［2］。蛋白質精氨酸甲基轉移酶2（protein arginine methyltransferase 2，PRMT2）作為一種新的ERα共激活子，在非洲綠猴腎COS-7細胞中能以激素依賴的方式提高ERα的轉錄活性［3］。本研究在前期工作中發現了PRMT2的3種新的差異剪接體，并分別將其命名為PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ（GenBank登陸號分別為FJ436410、FJ436411、FJ436412）。為了探索PRMT2基因新的剪接體是否與乳腺癌的發生有關，該研究采用基因轉染的方法，分別觀察PRMT2及其各剪接體融合蛋白在乳腺癌MCF-7細胞株中的表達及亞細胞定位，為進一步研究PRMT2及其新的剪接體在乳腺癌中的作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1．1 細胞株、質粒及主要試劑 JM109菌種、pGEM-T-PRMT2／α／β／γ載體均為南華大學附屬第一醫院臨床醫學研究所保存；乳腺癌細胞株MCF-7購自中國科學院上海細胞庫；陽離子脂質體轉染試劑（Lipofect AMINETM2000）、pcDNA3．1／NT-GFP載體、TRIzol試劑均購自美國Invitrogen公司；Blue Ranger預染蛋白分子標準購自美國Hyclone-Pierce公司；Cy3熒光素標記羊抗兔二抗、兔抗人ERα多克隆一抗及辣根過氧化酶購自美國Santa Cruz公司；各種培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Sigma公司。

1．2 細胞培養 MCF-7細胞采用含10%胎牛血清的MEM培養基進行培養，培養基中添加0.1 mmol／L非必需氨基酸、1.0 mmol／L丙酮酸鈉、0.01 mg／ml牛胰島素、1.5 g／L碳酸氫鈉，細胞置于37℃、5%CO2培養箱中靜置培養。取對數生長期細胞進行實驗。

1．3 PRMT2及其剪接體綠色熒光蛋白（green fluorescent portein，GFP）重組質粒的構建與鑒定 以本實驗室保存的pGEM-T-PRMT2／α／β／γ載體為模板，擴增PRMT2基因全長引物為上游：5′-ATG GCAACATCAGGTGACT-3′，下游：5′-TCATCTCCAGATGGGGAA-3′；擴增PRMT2α基因引物為上游：5′-ATGGCAACATCAGGTGACT-3′，下游：5′-TCAACT

GTCATCTCCAG-3′；擴增PRMT2β基因引物為上游：5′-ATGGCAACATCAGGTGACT-3′，下游：5′-TCATCACCCCTCAAGATAT-3′；擴增PRMT2γ基因引物為上游：5′-ATGGCAACATCAGGTGACT-3′，下游：5′-TCATCTCCAGATGGGGAAGA-3′；PCR反應體系為20 μl，其中上下游引物各1 μl，模板1 μl，2×Tag PCR Master Mix 10 μl，超純水7 μl，PCR儀上擴增。擴增產物連接至pcDNA3.1／NT-GFP-topo vector載體，反應體系為5 μl，其中PCR產物3 μl，topo vector 1 μl，salt solution 1 μl，37℃連接1 h后轉化，將篩選的引物進行PCR擴增，跑膠鑒定及測序（寶生物大連有限公司），Blast軟件進行比對分析。

1．4 PRMT2及其剪接體蛋白的亞細胞定位觀察取對數生長期細胞按3.5×105／孔密度接種于培養板。待細胞貼壁生長融合約50%時，將pcDNA3.1／NT-GFP-PRMT2／α／β／γ及空載體表達質粒轉染MCF-7細胞；具體操作參照Lipofect AMINETM2000說明書。48 h后，于室溫下細胞用3%多聚甲醛溶液固定10 min，0.1%Triton X-100穿透5 min，含Cy3標記的ERα抗體孵育2 h，DAPI染核3 min，每個步驟開始前均加入PBS沖洗細胞2次，激光共聚焦顯微鏡觀察PRMT2及其剪接體蛋白的亞細胞定位情況。

1．5 Western blot法檢測重組融合蛋白的表達用細胞裂解液裂解各組細胞，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度，具體方法參照BCA蛋白定量試劑盒說明書。于100℃水浴10 min，取等量總蛋白SDSPAGE分離，轉至硝酸纖維素膜上。TBST（含5%脫脂奶粉）封閉2 h后，加入兔抗人GFP多克隆一抗（1∶1 000）過夜；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶4 000）室溫孵育60 min，化學發光試劑盒顯色，壓片顯影，分析PRMT2及其剪接體GFP融合蛋白表達情況。

2 結果

2．1 PRMT2及其剪接體基因擴增 成功擴增出PRMT2及其剪接體基因全長，電泳鑒定PRMT2及其剪接體基因PCR擴增產物。PRMT2擴增條帶約為1 300 bp，PRMT2α與PRMT2β對應條帶約900 bp，PRMT2γ擴增條帶最小，約700 bp，與預計大小基本一致。見圖1。

2．2 外源性PRMT2及其剪接體蛋白的亞細胞定位 表達載體分別轉染MCF-7細胞，8h后，用激光共聚焦顯微鏡觀察MCF-7細胞中分別轉染了PRMT2及其新剪接體的真核表達質粒GFP的表達，結果顯示：剪接體PRMT2α與PRMT2γ融合蛋白的亞細胞分布同野生型PRMT2的分布一致，均聚集于核內除核仁外的核漿部分，胞質有少許分布。而PRMT2β則不同，融合蛋白均勻分布于胞質和胞核，包括核仁部分，與空載體GFP蛋白的分布一致。見圖2。

2．3 Western blot法檢測重組融合蛋白的表達 蛋白經過SDS-PAGE電泳轉膜，X線片曝光并顯影和定影后觀察到轉染了pcDNA3.1／NT-GFP-PRMT2／α／β／γ及空載體pcDNA3.1／NT-GFP都檢測到了條帶，表明各組融合蛋白在MCF-7細胞中的表達成功。見圖3。

3 討論

目前認為，ERα信號途徑活性的改變在乳腺癌的發生發展過程中起著重要的作用，而ERα共調節因子的變化，是導致ERα信號途徑活性改變的重要原因。正常情況下，雌激素水平在絕經后的婦女中是下降的，而ERα轉錄活性卻在絕經后的乳腺癌患者中表現增強，雌激素主要通過與ERα結合促進乳腺癌的發生發展。目前乳腺癌內分泌治療主要通過降低體內雌激素水平及抑制雌激素作用，達到抑制腫瘤細胞生長的目的，因此對ERα共調節因子的發現與研究對于指導乳腺癌內分泌藥物的有效研發具有重要意義。

PRMT2屬于PRMTs的成員之一［3］，在人染色體上定位于21q22．3末端著絲粒的位置，編碼433個氨基酸。PRMT2能通過多種機制發揮不同的轉

錄調節作用，包括轉錄因子甲基化［4］、組蛋白甲基化［5］、RNA差異剪接等［6］，并參與細胞分化［7］、炎癥反應［8］及細胞信號轉導［9］等過程。PRMT2所起的多種生物學作用主要依賴于其N-末端的SH3結構域。PRMT2主要通過直接黏附于ERα的AF-1或AF-2等結構域來充當ERα的共激活子，提高其轉錄活性［3］，然而PRMT2在乳腺癌細胞中的表達形式、調控ERα信號途徑的機制，目前尚未清楚。研究［7］表明，PRMT2能阻斷IkB-α的核輸出，抑制NF-κB依賴的轉錄，促進細胞凋亡。PRMT2還能與視網膜細胞瘤基因和E2F1結合，形成三體復合物來抑制E2F1轉錄活性，延緩細胞從G1期至S期的進程，促進細胞凋亡［10］。這些結果均表明PRMT2可通過多種機制發揮不同的轉錄調節作用。

高等真核細胞可以通過選擇性剪接使蛋白質組產生多樣性，這是轉錄后水平調控基因表達的重要機制。從細胞生理、發育調控到疾病的發生發展都與選擇性剪接密切相關。近年的研究［11］表明，發生在編碼蛋白質基因的差異性剪接與許多腫瘤的形成和發展密切相關，并且有些選擇性剪接是腫瘤所特有的。研究選擇性剪接的發生以及探索相應蛋白異構體的功能對于腫瘤的診斷和治療具有十分重要的意義。

為了探索PRMT2基因及其差異剪接體的功能，本研究構建了PRMT2基因及其各差異剪接體的真核表達載體，利用基因轉染的方法來初步探討PRMT2及其剪接體的生物學功能。本研究通過脂質體介導轉染后采用Western blot法證實了MCF-7細胞中PRMT2及其剪接體融合蛋白均獲得較高表達。轉染后48 h，用激光共聚焦顯微鏡觀察外源性PRMT2及其差異剪接體PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ融合蛋白在MCF-7細胞中GFP的表達，結果顯示PRMT2及其差異剪接體的融合蛋白在各組細胞中均有表達，但其分布位置不一致。由此推測，PRMT2及其剪接體之間出現的亞細胞定位差異很可能是由選擇性剪接引起的。PRMT2各差異剪接體在乳腺癌MCF-7細胞中擁有不同的亞細胞定位，提示其生物學意義可能有所不同。PRMT2新的剪接體在體內的作用如何，是否與其亞細胞定位有關，其差異剪接是否對ERα信號轉導途徑產生影響，是否將成為一個新的腫瘤標志物，有待于進一步研究證實。

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Subcellular localization of PRMT2 gene and its splicings in breast cancer MCF-7 cells

Chen Yajun1，2，3，Zhong Jing1，Yang Jing1，et al
（1Institute of Clinical Medical Research，The First Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang 421001；2Dept of Endocrinology，The Second Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang 421001；3Dept of Pathophysiology，University of South China，Hengyang 421001）

AbstractObjective To construct eukaryotic expression vectors pcDNA3．1／NT-GFP-PRMT2 and its splicings pcDNA3．1／NT-GFP-PRMT2α／β／γ and transfected into breast cancer MCF-7 cells，observe the subcellular localization of GFP-fusion protein in order to investigate the role of PRMT2 and its splicings in breast cancer．Methods The PRMT2 and its splicings genes were amplified from the vectors pGEM-T-PRMT2／α／β／γ，then subcloned into pcDNA3．1／NT-GFP-topo vector and sequenced．The recombinant pcDNA3．1／NT-GFP-PRMT2／α／β／γ，were transfected into breast cancer MCF-7 cells by lipofectamine respectively．The expression of green fluorescent protein was observed under laser scanning microscope，and the expression levels of PRMT2α／β／γ fusion protein were indentified by western blot．Results The expression of GFP fusion protein of PRMT2 and its splicings were observed under the laser scanning microscope，indicating that PRMT2α and PRMT2γ GFP fusion protein resulted in the nuclei except the nucleolus，cytoplasm has diffusion to scatter，as well as that of PRMT2．PRMT2β and N-GFP protein showed scatter homogeneously in nuclei and cytoplasm．Western blot indicated the recombinant PRMT2 and its splicings PRMT2α／β／γ genes were respectively expressed in breast cancer MCF-7 cells．Conclusion The subcellular localization of PRMT2 and its splicings are different and which maybe suggests they that the distinct roles in breast cancer．

Key wordsbreast cancer；protein-arginine N-methyltransferase 2；splicings；subcellular localization

作者簡介：陳亞軍，女，碩士；文格波，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：wen＿gb ＠hotmail．com

基金項目：國家自然科學基金青年基金資助項目（編號：31200573）；湖南省自然科學基金資助項目（編號：13JJ6051）

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0423－04

中圖分類號R 737．9