人卵丘細胞lncRNA ENST00000502521的表達與胚胎發育的關系

李 娟，曹云霞，劉婷婷，許孝鳳

人卵丘細胞lncRNA ENST00000502521的表達與胚胎發育的關系

李 娟，曹云霞，劉婷婷，許孝鳳

摘要目的 探討體外受精（IVF）周期人卵丘細胞（CCs）中lncRNA ENST00000502521的表達與卵母細胞成熟及胚胎發育的關系，判斷其對體外受精-胚胎移植（IVF-ET）結局的預測價值。方法 收集40例首次接受長方案超促排卵患者的卵丘細胞，根據卵丘細胞圍繞的卵母細胞受精后胚胎發育情況將卵丘細胞分成兩組，優質胚胎組和低質胚胎組，采用實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（qRT-PCR）技術檢測兩組卵丘細胞中lncRNA ENST00000502521的相對表達量，分析其與胚胎發育及妊娠結局的關系；采用受試者工作特征曲線（ROC）評價lncRNA ENST00000502521相對表達量對臨床妊娠結局的預測價值。結果 IVF患者低質胚胎組中lncRNA ENST0000050252表達較優質胚胎組明顯增高（P＜0.05），且未妊娠組lncRNA ENST00000502521相對表達量較妊娠組增高（P＜0.05）；lncRNA ENST00000502521預測妊娠結局的ROC曲線下面積（AUC）為0.71（P＜0.05，95%CI：0.55～0.87），靈敏度為84.2%，特異性為61.9%。結論lncRNA ENST00000502521可能參與影響卵母細胞成熟及胚胎發育，可作為一個潛在的分子標志物預測胚胎質量和妊娠結局。

關鍵詞卵丘細胞；長鏈非編碼RNA；ENST00000502521；胚胎發育

2015-03-16接收

作者單位：安徽醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心，合肥 230022

人卵丘細胞與卵母細胞關系密切，通過對卵丘細胞基因表達譜的研究可以找到預測卵母細胞質量、胚胎發育潛能及妊娠結局的分子標志物［1-4］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNA）是一類轉錄本長度超過200nt的RNA分子，參與了多種病理生理過程［5-6］。最近Yerushalmi et al［7］采用芯片技術發現人卵丘細胞中有大量lncRNA產生，其中有一些可能參與了卵母成熟、受精及胚胎發育。在該實驗前期的卵丘細胞芯片表達譜結果的基礎上，并結合生物信息學分析發現一個新的lncRNA ENST00000502521位于3號染色體q22.1上，但其是否是影響胚胎發育及妊娠結局的關鍵調控基因，目前還不清楚，因此需要進一步驗證芯片表達譜的結果。該研究采用實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術檢測不同質量卵母細胞來源的卵丘細胞中lncRNA ENST00000502521的相對表達量，分析其與胚胎發育及妊娠結局的關系，為進一步探討其在卵母細胞成熟、受精及胚胎發育過程中的調控機制提供研究基礎。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 卵丘細胞來源 卵丘細胞來源于安徽醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心首次行長方案體外受精（in vitro fertilization，IVF）治療的40例不孕癥患者，年齡20～35（31.19±5.29）歲，不孕因素為女方輸卵管因素，男方因素引起的不孕不納入研究范圍。

1.1.2 主要試劑 Total RNA Isolation Kit I（美國Omega公司）；PrimeScriptRT reagent Kit和熒光定量PCR試劑盒SYBRPremix ExTaq II kit（日本TaKaRa公司）。

1.2 方法

1.2.1 卵巢刺激方案 患者均采用常規長方案控制性促排卵。自前一個月經周期的黃體中期開始使用促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotrophin releasing hormone agonists，GnRH-a）（達菲林）降調節，月經周期第3～5天開始使用重組促卵泡素（果納芬）150～300 IU／d，定期進行陰道B超監測卵泡發育及血清雌二醇、孕酮、黃體生成素水平的測定，當主導卵泡中有1個直徑達到18 mm或2個達17 mm或3個達16 mm時，于當天停用促性腺激素，當晚約10時予以人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）10 000 IU肌注，注射HCG后約36 h行取卵術。

1.2.2 卵丘細胞的收集 取卵后在卵母細胞-放射冠-卵丘復合物上劃取部分卵丘細胞團，分別單獨放入一個微量離心管，-80℃冷凍保存。卵母細胞單獨受精培養，受精后第2天觀察胚胎卵裂情況，第3天行卵裂球期胚胎評分。

1.2.3 實驗分組 根據受精后第3天卵裂球數目、形態、胞質顆粒和胞漿碎片等參數行胚胎形態學評分。細胞團均勻對稱，細胞數≥7個，大小一致，碎片≤20%的胚胎為優質胚胎；細胞團不對稱，細胞數＜7個，大小不一致，碎片＞20%的胚胎為形態學差質量胚胎。優質胚胎組卵丘細胞來自于受精后評分為優質胚胎的卵母細胞，低質胚胎組卵丘細胞來自于受精后為差質量胚胎的卵母細胞。

1.2.4 臨床妊娠判定標準 胚胎移植后第14天測尿HCG或血HCG行生化妊娠初步診斷，于移植后第35天行超聲檢查，宮腔內見孕囊或（和）胎心搏動者（包括宮外妊娠）診斷為臨床妊娠。

1.2.5 RNA提取和qRT-PCR 使用Total RNA Isolation Kit I提取細胞總RNA后將其濃度定為200～300 ng／μl，于-80℃保存備用。根據PrimeScriptRT reagent Kit和SYBRPremix ExTaq II kit說明書逆轉錄提取到的RNA后進行RT-PCR，以GAPDH為內參。lncRNA ENST00000502521上游引物：5′-GGCAGGTTTCTCTTGTTGTCT-3′，下游引物：5′-GGCAGGTTTCTCTTGTTGTCT-3′；GAPDH上游引物：5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，下游引物：5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。采集每個定量PCR反應的閾循環值后，將定量PCR結果以2-ΔΔCt表示。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0進行數據統計分析。采用單樣本K-S檢驗方法檢驗變量是否符合正態分布；組間正態分布資料比較采用兩獨立樣本t檢驗；相關性分析采用Pearson法。采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）評價lncRNA ENST00000502521相對表達量對臨床妊娠結局的預測價值。

2　結果

2.1 IVF患者卵丘細胞中lncRNA ENST00000 502521表達 采用qRT-PCR技術檢測兩組卵丘細胞中lncRNA ENST00000502521的相對表達量。85%的患者（34／40）低質胚胎組lncRNA ENST00000502521表達水平高于優質胚胎組（P＜ 0.05）；優質胚胎組lncRNA ENST00000502521的表達水平為（9.15±2.56），低質胚胎組lncRNA ENST00000502521的表達量為（7.94±2.57）；低質胚胎組的表達量較優質胚胎組平均增高了約（2.75 ±1.36）倍，差異有統計學意義（P＜0.05）。lncRNA表達量采用ΔCt值表示，ΔCt值越大則代表lncRNA表達水平越低。見圖1。

2.2 IVF患者一般情況和lncRNA ENST00000 502521表達及妊娠結局的關系 采用相關性分析比較患者一般情況和卵丘細胞中lncRNA ENST0000 0502521表達及妊娠結局的關系。結果顯示：卵丘細胞中lncRNA ENST00000502521表達水平及妊娠結局與患者年齡、不孕年限、體質指數、基礎性激素水平、促性腺激素（gonadotropin，Gn）用量、Gn天數等一般情況無明顯相關性。

2.3 IVF患者卵丘細胞中lncRNA ENST000005 02521表達與妊娠結局的關系 按患者妊娠結局將40例患者分為妊娠組（n＝21）和未妊娠組（n＝19）。妊娠組lncRNA ENST00000502521表達量低質胚胎組（8.02±2.40）較優質胚胎組（9.49± 2.64）平均增高了（2.23±1.07）倍；未妊娠組lncRNA ENST00000502521表達量低質胚胎組（7.85 ±2.80）較優質胚胎組（8.77±2.49）平均增高了（3.21±1.44）倍；未妊娠組lncRNA ENST00000 502521相對表達量較妊娠組增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.4 lncRNA ENST00000502521相對表達量對臨床妊娠結局的預測價值 采用ROC曲線評價lncRNA ENST00000502521相對表達量對臨床妊娠結

局的預測價值。曲線下面積（area under curve，AUC）代表lncRNA ENST00000502521相對表達量對妊娠結局的預測價值。以卵丘細胞lncRNA ENST00000502521相對表達量為檢驗變量，以臨床妊娠結局為狀態變量（臨床妊娠＝1），建立ROC曲線（P＜0.05，AUC＝0.71，95%CI：0.55～0.87），靈敏度為84.2%，特異性為61.9%。見圖3。

3　討論

胚胎發育與種植潛能評估一直是人類輔助生殖領域的關鍵技術，選擇最具發育潛能的胚胎移植并建立妊娠是人類輔助生殖技術的首要目標。胚胎質量的優劣在很大程度上取決于所獲卵子的質量［8］。有研究［9］表明胚胎質量與卵母細胞質量密切相關。人卵丘細胞與卵母細胞關系密切，前者直接影響后者的發育、成熟及胚胎質量［10-11］。通過對卵丘細胞基因表達的研究，或許能夠發現可能作為卵母細胞質量、胚胎發育潛能及妊娠結局的分子標志物，并結合傳統形態學評分方法可以為胚胎選擇提供更加客觀、準確且無創的方法。

本研究排除男方因素可能對卵母細胞受精的影響，首先比較了來自不同質量胚胎對應的卵丘細胞中lncRNA ENST00000502521的相對表達量，發現低質胚胎組lncRNA ENST00000502521表達量較優質胚胎組明顯升高，說明lncRNA ENST00000502521參與影響卵母細胞成熟及胚胎發育。然而，尚不明確其中的調控機制。目前對lncRNA調控機制的研究主要是通過其位置相關或鄰近的編碼蛋白的基因。已有研究［12］報道低表達某一確定lncRNA可導致其附近某些編碼蛋白基因的表達水平降低。通過基因圖譜分析，lncRNA ENST00000502521屬于內在反義lncRNA轉錄本，所對應的正義轉錄本是位于3號染色體上。反義轉錄本認為在轉錄水平、基因印記、X染色體沉默、DNA甲基化、組蛋白修飾等多個水平上起調控作用［13］。推測該lncRNA可能通過對其靶基因的調控實現其生物學功能，對這一問題的闡釋還需要進一步研究證實。

IVF患者年齡、體重指數、基礎性激素水平等因素可能會影響最終的妊娠結局。本研究通過相關性分析排除了患者一般情況和lncRNA的表達水平及妊娠結局存在相關性的可能。成功妊娠是反映移植胚胎發育潛能的重要指標。本研究證實，未妊娠組lncRNA ENST00000502521相對表達量較妊娠組明顯增高。ROC曲線顯示該指標預測妊娠結局的靈敏度為84.2%，特異性為61.9%；說明卵丘細胞中lncRNA ENST00000502521相對表達量可以作為預測IVF患者妊娠結局的分子指標。

綜上所述，本研究首次表明人卵丘細胞中lncRNA ENST00000502521的表達水平參與影響卵母細胞成熟及胚胎發育，但確切的調控機制還需要進一步研究。此外，檢測IVF患者卵丘細胞中lncRNA ENST00000 502521的相對表達量可能有助于預測IVF妊娠結局。

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The expression of lncRNA ENST00000502521 in human cumulus cells and embryo developmental competence

Li Juan，Cao Yunxia，Liu Tingting，et al
（Reproductive Medicine Center，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

AbstractObjective To explore the expression of lncRNA ENST00000502521 in human cumulus cells of women undergoing in vitro fertilization（IVF）and the relationship between lncRNA ENST00000502521 and oocyte maturation and embryo development.Moreover，its predictive value of IVF outcome was also discussed.Methods The expression of lncRNA ENST00000502521 was measured in 40 pairs of cumulus cells from oocytes resulting in highquality embryo and from oocytes resulting in poor-quality embryo by real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction（qRT-PCR），and further associated these data with embryo developmental potential and competence to establish a pregnancy.The predictive value of the lncRNA ENST00000502521 was evaluated using a receiver operating characteristic（ROC）curve.Results Notably elevated lncRNA ENST00000502521 expression levels were observed in the group poor-quality embryo compared to the group high-quality embryo（P＜0.05）.The relative expression levels of lncRNA ENST00000502521 in the non-pregnancy group were significantly higher than those in the pregnancy group（P＜0.05）.The area under the ROC curve（AUC）of lncRNA ENST00000502521 was 0.71（P＜0.05，95%CI：0.55～0.87）and had a sensitivity of 84.2%and a specificity of 61.9%to predict embryo developmental potential.Conclusion The relative expression levels of lncRNA ENST00000502521 may be considered as potential biomarkers to predict embryo developmental competence and IVF outcome.

Key wordscumulus cells；long noncoding RNAs；ENST00000502521；embryo developmental competence

作者簡介：李 娟，女，碩士研究生；曹云霞，女，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：caoyunxia6＠126.com

基金項目：國家重大科學研究計劃（編號：2012CB944704）

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0569-04

中圖分類號R 714.2