印度-西太平洋胡椒鯛亞科魚類DNA條形碼及分子系統進化研究

梁日深 譚佳瑜 梁志剛 薛 濤 方浩航 吳灶和

(仲愷農業工程學院, 生命科學學院, 廣州 510225)

印度-西太平洋胡椒鯛亞科魚類DNA條形碼及分子系統進化研究

梁日深 譚佳瑜 梁志剛 薛 濤 方浩航 吳灶和

(仲愷農業工程學院, 生命科學學院, 廣州 510225)

為探討COⅠ基因作為條形碼在胡椒鯛亞科魚類物種鑒定的可行性, 研究測定了胡椒鯛亞科8種魚類51個個體線粒體COⅠ基因長度為651 bp的序列, 利用MEGA 5.0計算胡椒鯛亞科種內與種間的遺傳距離,基于最大似然法與貝葉斯法構建了系統進化樹。結果顯示: 胡椒鯛亞科魚類種間平均遺傳距離(0.142)顯著大于種內平均遺傳距離(0.003), 物種間遺傳距離均大于Hebert推薦的物種鑒定最小種間遺傳距離0.020(2%)。系統進化樹上, 同一物種不同個體間均能形成獨立的單系分支, 表明 COⅠ基因可作為胡椒鯛亞科物種鑒定的有效條形碼基因。研究同時揭示, 在形態分類上被認為是同種異名的兩種胡椒鯛(條紋胡椒鯛與東方胡椒鯛)的COⅠ基因序列差異達到0.070, 有可能是兩個獨立的物種。此外, 在屬級水平, 少棘胡椒鯛屬與胡椒鯛屬種類之間的平均遺傳距離小于胡椒鯛屬內部種間的遺傳距離, 支持少棘胡椒鯛歸屬于胡椒鯛屬的觀點。

DNA條形碼; COⅠ基因; 胡椒鯛亞科; 系統分類

胡椒鯛亞科(Plectorhynchinae)隸屬鱸形目Perciformes鱸亞目 Percoidei仿石鱸科Haemulidae,包括胡椒鯛屬(Plectorhinchus), 少棘胡椒鯛屬(Diagramma)以及磯鱸屬(Parapristipoma), 廣泛分布于印度洋及太平洋西部溫帶, 亞熱帶及熱帶沿海及島礁海域, 是重要的海洋經濟食用及觀賞性魚類。世界上胡椒鯛亞科種類共記錄30余種, 中國約8—12種, 主要分布在南海[1—4]。

胡椒鯛亞科魚類是一類外部形態會隨著個體發育逐漸變化的特殊類群, 幼魚與成魚在體色和斑紋上存在巨大差別。基于傳統形態學分類方法, 許多物種難以準確鑒定, 導致目前形態學分類資料中物種命名十分混亂[1—6]。而在分子水平鑒定上, 關于胡椒鯛亞科魚類的分子系統分類研究還沒見報道, 僅在部分石鱸科魚類系統進化分析研究涉及零星的胡椒鯛亞科魚類, 如朱世華等[7]利用Cyt b基因分析5種仿石鱸科魚類; 任崗等[8]利用16S rRNA序列分析了 11種仿石鱸科魚類以及國外 Sanciangco等[9]與 Tavera等[10]利用多個分子標記分析北美海域的 30多種仿石鱸科魚類的分子系統進化等, 其研究涉及的胡椒鯛亞科數目很少, 且重點分析內容均放在其他類群, 對于胡椒鯛亞科物種分類的數據分析十分缺乏, 關于胡椒鯛亞科魚類的系統性的分類與鑒定研究依然存在巨大空白。

近年來, DNA條形碼(DNA Barcoding)技術在分子系統進化, 物種快速鑒定上引起越來越多的關注。DNA條形碼是通過一個標準目的基因的DNA序列分析從而進行物種鑒定的技術[11,12]。在魚類中該基因是線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因5′端一段長度為648 bp的片段, 它能在分子水平上成功區分物種, 為生物的分類提供一種快速簡便、可信可靠的分類方法[32]。目前, 世界各地已經開展了不同地理海區魚類的DNA條形碼研究分析, 在物種保護與鑒定研究工作中取得了不小的突破[13—15]。

本研究選擇DNA條形碼標準基因——COⅠ作為標記, 分析胡椒鯛亞科魚類分子系統進化關系,探討 COⅠ基因在胡椒鯛亞科魚類物種分子鑒定的有效性, 為解決胡椒鯛亞科形態分類混亂與物種鑒定困難的問題提供分子水平的分類學依據, 為今后的相關模糊物種的分類鑒定提供快速便捷鑒定依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

胡椒鯛亞科標本材料主要在南海采集。此外,部分世界其他海區分布的樣品主要由以下單位提供:南非水生物多樣性研究院(South African Institute for Aquatic Biodiversity, SAIAB)、美國堪薩斯大學生物

多樣性研究中心(Biodiversity Institute, University of Kansas)、南太平洋島國新喀里多尼亞努美阿瀉湖水族館(Noumea Aquarium des Lagons)。最后共得到胡椒鯛亞科樣品材料18種(表1)。實驗材料均取肌肉或尾鰭, 于 95%的乙醇固定, 用于實驗室基因組DNA提取。

1.2 總基因組DNA的提取

基因組DNA提取采用改良的酚/氯仿抽提法。提取的DNA溶解于50 μL滅菌水中, 經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, –20℃保存備用。

1.3 PCR擴增及序列測定

用于擴增 COⅠ基因片段序列的引物為 DNA條形碼通用引物: COⅠ-F1: 5′-TCAACYAATCAYAA AGATATYGGCAC-3′, COⅠ-R1: 5′-ACTTCYGGGTGRCCRAARAATCA-3′[16]。PCR反應體系為50 μL,其中10×buffer 5 μL, dNTPs (各2.5 mmol/L) 2 μL, 上下游引物各1 μL, Ex Taq酶(1 U/μL) 2 μL。PCR反應條件為: 94℃預變性5min, 94℃變性30s, 60℃退火1min, 72℃延伸1min30s, 35個循環, 最后72℃延伸10min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,純化后送到上海英駿生物技術有限公司進行雙向測序。

表1 實驗材料的種類和采集地Tab. 1 The experimental species and the origins

1.4 數據分析

所得序列運用 BioEdit 軟件查看序列結果并輔助測序峰圖進行人工校正。利用Clustal W[17]進行序列排列比對, 去除兩端冗余序列。利用 MEGA 5.0[18]計算序列的堿基組成、序列間的堿基變異頻率和轉換顛換頻率, 基于Kimura’s 2-parameter模型計算各物種的遺傳距離。分子系統進化樹利用最大似然法(Maximum likelihood, ML)和貝葉斯法(Bayesian inference, BI)進行構建。最大似然樹在PHYML v2.4.4軟件中完成, 分支的置信度采用重復抽樣分析(Bootstrap analysis)方法, 重復抽樣的次數為1000次。貝葉斯法分析在 MrBayes 3.1.2[20, 21]軟件中完成, 隨即選取起始樹, 計算1000000代, 取樣代數100, 系統進化樹節點置信度由后驗概率(Posterior probabilities)提供。

2 結果

2.1 序列分析

本研究中, 所獲得序列是 COⅠ基因 5′端的一段長度為651 bp的片段, 編碼272個氨基酸, 無堿基的插入、缺失。序列堿基組成中A、T、G、C 堿基平均含量分別為 23.1%、27.5%、19.5%、29.9%, 其中 A+T 含量(50.6%)略高于G+C 含量(49.4%)。密碼子第1位4種堿基含量相差不大, 其中G-1含量最高, 占31.3%, 密碼子第2位中, T-2含量明顯高于其他3種, 占41.0%, 密碼子第3位中C-3含量最高,為33.2%, 而G-3含量僅有14.3%, 表現出明顯的反G偏倚(圖1)。在G+C含量中, 密碼子第1位點G+C含量(56.7%)顯著高于第2和第3密碼子位點(43.1% 和 48.4%)。此外, 在長度為 651 bp序列中, 除去外類群, 保守位點 430個, 約占 66.1%; 變異位點221個, 約占34.0%; 簡約性信息位點183個, 約占28.1%。

圖1 COⅠ基因第一、二、三位密碼子堿基組成Fig. 1 The composition of the 1st, 2nd, 3rd codon of COⅠgene

所有個體序列核苷酸變異情況見表 2。序列中轉換與顛換之比值為3.24 (Kimura 2-parameter模型),轉換明顯大于顛換, 顯示這些位點沒有突變飽和。全部位點中不變位點有 567個, 轉換位點有 64個,顛換位點有20個。其中不變位點屬第2密碼子位點最多, 為 217個; 而轉換位點和顛換位點均屬第 3密碼子位點最多, 分別為58個和19個(表2)。這可能與密碼子第 3位發生的堿基替換不易造成氨基酸突變, 第1、第2位點的替換容易引起氨基酸突變有關。

2.2 種間及種內的遺傳距離

基于Kimura 2-parameter模型計算出18種胡椒鯛亞科種內與種間遺傳距離如表 3所示, 在所有胡椒鯛亞科魚類中, 種內遺傳距離為 0.000—0.010,其中斑胡椒鯛種內遺傳距離最大, 為0.010, 其余種類種內遺傳距離均低于 0.005, 平均遺傳距離為0.003, 顯著低于Hebert等[11]所推薦的物種鑒定最小種間遺傳距離0.020 (2%)。18種胡椒鯛亞科魚類種間平均遺傳距離為0.142, 是種內遺傳距離的47倍,其中最大種間遺傳距離為查氏胡椒鯛與黑胡椒鯛(0.193); 最小種間遺傳距離為查氏胡椒鯛與紅唇胡椒鯛(0.036), 均大于 Hebert等[11]設定的 2%的遺傳差異。此外, 歸類于少棘胡椒鯛屬的兩種少棘胡椒鯛與胡椒鯛屬的種類遺傳距離范圍在 0.084—0.194之間, 平均遺傳距離為0.134, 少于胡椒鯛屬內種間的平均遺傳距離0.141。

表2 COⅠ片段堿基轉換和顛換數Tab. 2 Numbers of transition and transversion of COⅠ sequences

2.3 胡椒鯛亞科科魚類分類及分子系統樹

基于所得序列, 采用ML法和BI法, 對胡椒鯛亞科3個屬18種魚類51個個體構建分子系統樹(圖2), 兩者得到的系統樹具有相似的拓撲結構, 并且都具有較高的節點支持率。在進化樹上, 胡椒鯛亞科同種魚類不同個體均聚為同一分支, 各自形成單系, 節點支持率為100%。18種魚類大致形成4個類群, 其中磯鱸屬位于石鱸亞科類群基部, 種類數量最多的胡椒鯛屬在進化樹上并沒有形成嚴格的單系,少棘胡椒鯛屬以較高節點支持率位于胡椒鯛屬內部,與胡椒鯛屬中的斑胡椒鯛與暗點胡椒鯛有較近的親緣關系。

表3 基于 Kimura-2模型計算17種胡椒鯛亞科魚類COⅠ種內遺傳距離(最后一列)及種間平均遺傳距離(下三角) Tab. 3 Pairwise distances among 22 species of for COⅠ sequences based on Kimura-2-Parameter model

圖2 18種胡椒鯛魚類基于COⅠ序列利用最大似然法與貝葉斯法構建的分子系統進化樹Fig. 2 The molecular phylogenetic trees of 18 Sweetlips constructed by maximum likelihood and Bayesian inference method, based on CO Ⅰsequences

3 討論

3.1 DNA條形碼在胡椒鯛亞科魚類物種鑒定中的適用性

研究表明, 較大的種間序列差異是對物種進行準確鑒定的先決條件[22]。利用 DNA條形碼對物種進行正確分類取決于種內遺傳距離和種間遺傳距離之間的差異大小, 即條形碼缺口(Barcoding gap)。Hebert等[11]對11個門13320個物種的COⅠ基因序列進行分析, 發現 COⅠ序列間的差異能夠很好地區分所有研究物種, 其分析得出物種內的 COⅠ遺傳距離很少有大于 2%, 大部分的種內距離是小于1%。同時, Hebert等[11, 12]提出, 利用COⅠ序列有效地進行物種鑒別的關鍵點是種間的遺傳距離必須大于種內的遺傳距離, 并且距離差異大約為10倍。在本研究中18種胡椒鯛亞科魚類51個個體的種內遺傳距離平均值為 0.003, 種間遺傳距離平均值為0.142, 種間遺傳距離是種內的47倍。此外, 胡椒鯛亞科魚類種內遺傳距離范圍為 0.000—0.010, 顯著低于Hebert等[11]所推薦的物種鑒定最小種間遺傳距離0.020 (2%); 而種間遺傳距離范圍為0.036—0.193,大于Hebert設定的2%的遺傳差異。可知, COⅠ基因序列作為胡椒鯛亞科 DNA條形碼, 可有效進行物種的分子鑒定分析。

3.2 基于 DNA條形碼序列胡椒鯛亞科魚類分子系統進化關系分析

本研究基于 COⅠ序列構建的系統進化樹, 胡椒鯛亞科同種魚不同個體均可聚在同一分支內, 形成嚴格的單系, 不同物種間的聚類關系均擁有較高的支持率。在系統進化樹上, 胡椒鯛亞科中的磯鱸屬分類地位最低, 位于進化樹的基部。而種類數目最多的胡椒鯛屬主要形成三個分支, 分支一的胡椒鯛屬魚類絕大多數種類具有鮮艷的色彩與斑紋, 分支二與分支三的胡椒鯛屬魚類, 大多體色單一, 無鮮艷色彩與斑紋, 進化樹上許多種類都以高支持率聚成姐妹種, 結果可為形態學存在爭議的物種分類提供分子生物學證據[5, 6]。

3.3 P. vittatus與P. orientalis物種有效性分析

目前絕大多數分類資料認為條紋胡椒鯛 P. vittatus (Linnaeus, 1758)與東方胡椒鯛 P. orientalis (Bloch, 1793)均為同一個物種: Oriental sweetlips[23—26]。Satapoomin與Randall[27]研究也指出, P. vittatus與P. orientalis兩者是同種異名, P. vittatus是有效種名[28]。本研究分別獲得鑒定為條紋胡椒鯛與東方胡椒鯛的樣本材料, 其中條紋胡椒鯛標本由南非水生生物多樣性研究所(SAIAB)提供, 共 3尾樣本, 采集于西印度洋的塞舌爾群島; 東方胡椒鯛標本由作者采集于西沙群島, 共 4尾樣本。基于 COⅠ基因分析表明, 條紋胡椒鯛與東方胡椒鯛的平均遺傳距離為0.070, 顯著高于Hebert等[11]所推薦的最小種間遺傳距離0.020 (2%), 并且大于部分胡椒鯛屬內部種間遺傳距離: 如查氏胡椒鯛與紅唇胡椒鯛(0.036)、查氏胡椒鯛與白條胡椒鯛(0.048)等。而兩種胡椒鯛種內個體間平均遺傳距離僅分別為 0.002 與 0.003, 遠遠小于其種間的遺傳距離。這顯示條紋胡椒鯛與東方胡椒鯛在基因上已經達到種以上的分化水平。在進化樹上, 條紋胡椒鯛、東方胡椒鯛的個體分別聚為一支, 然后兩者再相聚, 進化樹上的枝長差異清晰把兩種胡椒鯛區分開來。故基于分子水平的研究結果, 本研究認為, 條紋胡椒鯛與東方胡椒鯛可能是兩個獨立的物種, 不應該確定為同種異名。

3.4 少棘胡椒鯛屬在胡椒鯛亞科中的系統進化地位

基于 COⅠ序列差異分析, 少棘胡椒鯛屬與胡椒鯛屬平均種間遺傳距離(0.134)少于胡椒鯛屬內部平均種間遺傳距離(0.142)。并且在個體上, 大部分胡椒鯛屬與少棘胡椒鯛屬個體之間的遺傳距離比其自身屬內種間的遺傳距離要小很多。在系統進化樹上, 少棘胡椒鯛屬的分類地位沒有獨立于胡椒鯛屬類群之外, 而是位于胡椒鯛屬內部, 與斑胡椒鯛和暗點胡椒鯛的種類聚在一起, 顯示少棘胡椒鯛與胡椒鯛屬之間很近的親緣關系。該結果與近期分子系統分類研究一致[8—10], Sanciangco等[8]與Tavera等[9]對北美仿石鱸科魚類的系統分類研究均揭示少棘胡椒鯛位于胡椒鯛屬的內部。Tavera等[9]認為少棘胡椒鯛屬與胡椒鯛屬應該歸為同一個屬。在形態上,少棘胡椒鯛屬與胡椒鯛屬的一個主要形態差異就是少棘胡椒鯛屬背鰭鰭棘數比胡椒鯛屬要少, 前者數目為9—10, 后者為12—14[5, 6, 29—31]。此外, 兩者之間軟鰭條數目和側線上鱗數也存在差別。在分子水平上, 少棘胡椒鯛屬與胡椒鯛屬之間的差異很小,本研究結果也支持了將少棘胡椒鯛屬歸為胡椒鯛屬的分類學觀點。

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THE DNA BARCODING, CLASSIFICATION, AND PHYLOGENY OF INDO-WESTERN PACIFIC PLECTORHYNCHINAE

LIANG Ri-Shen, TAN Jia-Yu, LIANG Zhi-Gang, XUE Tao, FANG Hao-Hang and WU Zao-He
(College of Life Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China)

To explore whether COⅠsequences could be used as the DNA barcodes in the identification of Plectorhynchinae species, we analyzed the 651 bp COⅠsequences from 51 individuals of 18 Plectorhynchinae fish in this study. The genetic distances between and within species were calculated using MEGA 5.0, and the molecular phylogenetic trees were constructed using the maximum likelihood and Bayesian inference methods. The results showed that the average inter-species genetic distance (0.142) was 47 times higher than the average intra-species genetic distance (0.003). All the interspecies genetic distances were larger than the minimum value 0.020 (2%) suggested by Hebert for the species identification. In the molecular phylogenetic trees, each individual of the same species could form an independent monophyletic group, indicating that COⅠcould be potentially used as an effective barcode gene in the rapid and accurate identification of Plectorhynchinae species. According to the genetic distance values, we found that two Plectorhinchus species, P. orientalis and P. vittatus which were conventionally regarded as synonyms, could be actually two distinct species because of their large COⅠgenetic variations (0.070). The average genetic distance between Diagramma and Plectorhinchus was lower than the values of intra-Plectorhinchus species, which implied that the genetic variation between Diagramma and Plectorhinchus might be below the significant level. This supported the notion that Diagramma could be classified into the Plectorhinchus genus.

DNA barcodes; COⅠgene; Plectorhynchinae; Phylogeny

Q346+.3

A

1000-3207(2015)04-0766-08

10.7541/2015.100

2014-10-08;

2015-01-12

國家自然科學基金項目(30972258); 廣東省大學生創新創業訓練計劃項目(201511347028); 仲愷農業工程學院大學生創新基金項目(2014A23)資助

梁日深(1984—), 男, 廣東開平人; 博士, 講師, 主要研究方向為水生生物學。E-mail: cheetahliang@126.com