響應(yīng)面法優(yōu)選熒光測(cè)定維生素C的工藝條件研究

張 鼎，陳 帥，高淑云

(徐州工程學(xué)院，江蘇徐州 221008)

?

響應(yīng)面法優(yōu)選熒光測(cè)定維生素C的工藝條件研究

張 鼎，陳 帥，高淑云*

(徐州工程學(xué)院，江蘇徐州 221008)

[目的]利用苯甲酸與維生素C反應(yīng)生成熒光物質(zhì)的特性，建立一種測(cè)量維生素C含量的方法。[方法]試驗(yàn)采用氫氧化鈉-鄰苯二甲酸氫鉀作為緩沖溶液調(diào)節(jié)緩沖液pH，并通過(guò)對(duì)測(cè)定前處理樣品的時(shí)間、溫度、緩沖液pH以及苯甲酸用量等單因素試驗(yàn)來(lái)確定最佳單因素水平，并用響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)條件，確定以苯甲酸為促熒光物質(zhì)測(cè)定飲品中維生素C的最佳測(cè)定條件。[結(jié)果]苯甲酸對(duì)維生素C促熒光明顯，可在激發(fā)波長(zhǎng)310 nm，發(fā)射波長(zhǎng)410 nm處測(cè)其產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。維生素C濃度在1.00×10-4～5.05×10-4g/ml范圍內(nèi)其熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限較低，相關(guān)系數(shù)為0.989。[結(jié)論]研究表明，熒光法測(cè)定飲品中維生素C結(jié)果比較準(zhǔn)確，方法可行。

維生素C；熒光分析法；苯甲酸；響應(yīng)面法

維生素C的測(cè)定方法主要有光度法、電化學(xué)法、滴定法、酶法、色譜法等[1]。Deutsch和Weeks曾經(jīng)報(bào)道過(guò)一種檢測(cè)維生素C的熒光分析法(OPDA)，并被指定為維生素C的經(jīng)典熒光分析法。在該方法中，維生素C先被活性炭(Norit)氧化為脫氫抗壞血酸(DHAA)，DHAA再與熒光底物鄰苯二胺(OPDA)結(jié)合生成熒光產(chǎn)物，通過(guò)對(duì)該熒光產(chǎn)物的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)維生素C的定量分析[2]。鄰苯二胺本身有很強(qiáng)的熒光，而且過(guò)量的活性炭會(huì)吸附一定量的維生素C，所以有人提出了一種新的測(cè)定維生素C的熒光分析方法[3]。基于維生素C被Cu2+氧化為DHAA，DHAA進(jìn)一步與苯甲酸及十六烷基三甲基溴化銨產(chǎn)生熒光協(xié)同增敏作用，通過(guò)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的測(cè)定進(jìn)行維生素C的定量分析。該方法所涉及的體系穩(wěn)定性好，但需要進(jìn)行加熱，且反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)[4]。

該研究的基本思路是，在試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，嘗試探索和尋找一種效果更好的氧化劑氧化維生素C(抗壞血酸)。在不外加氧化劑的條件下，苯甲酸與維生素C在特定的酸度條件下可反應(yīng)生成一種較強(qiáng)的熒光物質(zhì)，其熒光強(qiáng)度與維生素C的濃度成正比，據(jù)此建立了新的熒光測(cè)定維生素C的方法。與經(jīng)典的Deutsch熒光方法相比，反應(yīng)底物熒光較弱，降低了背景干擾，與文獻(xiàn)報(bào)道的熒光方法相比，該反應(yīng)不需外加氧化劑，且反應(yīng)時(shí)間較短，反應(yīng)條件控制較容易。

1 材料與方法

1.1 材料原料與試劑：鄰苯二甲酸氫鉀(GR)、苯甲酸(GR)、氫氧化納(GR)，天津市化學(xué)試劑研究所；抗壞血酸(99%)，上海研生實(shí)業(yè)有限公司；檸檬味脈動(dòng)飲料，購(gòu)于超市。主要儀器：日立F-2700熒光分光光度計(jì)，日立高新技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱(chēng)取維生素C標(biāo)準(zhǔn)物0.050 5 g，用超純水溶解后倒入100 ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻，得到5.05×10-4g/ml的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液。取5個(gè)50 ml的容量瓶，編號(hào)1、2、3、4、5，分別加入0、1.0、1.5、2.0、2.5 ml維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，各加入10 ml緩沖液和體積分別為0、1.50、2.25、3.00、3.75 ml的苯甲酸溶液，定容至刻度，搖勻后放入35 ℃水中加熱15 min。在選定的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)下用熒光計(jì)分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度值(y) 對(duì)維生素C濃度(x)作圖得出回歸方程。

1.2.2測(cè)定條件的選定。

1.2.2.1pH對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。配制7份pH依次為3.85、6.00、6.55、7.00、7.60、8.05、9.11的氫氧化鈉-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液備用。分別移取樣品5.0 ml置7個(gè)50 ml容量瓶中，各加入pH 3.85、6.00、6.55、7.00、7.60、8.05、9.11的緩沖液10.0 ml，再分別加入7.5 ml苯甲酸溶液，定容至刻度。在35 ℃水中反應(yīng)15 min后，用熒光計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.2.2.2溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。取5個(gè)50 ml容量瓶，分別加入5.0 ml樣品、10.0 ml緩沖液(pH=7)和7.5 ml苯甲酸溶液(1.095×10-4g/ml)定容至刻度。分別置于溫度為20、35、40、45、55、65 ℃的水中加熱15 min后測(cè)定其熒光強(qiáng)度。

1.2.2.3時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。取5個(gè)50 ml容量瓶，分別加入5.0 ml樣品、10.0 ml緩沖液(pH=7)和7.5 ml苯甲酸溶液，定容至刻度。分別在常溫下靜置5、10、15、20、25 min測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.2.2.4苯甲酸對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。取4個(gè)50 ml容量瓶，分別加入5.0 ml樣品和10.0 ml pH為7.0的緩沖溶液，再分別加入2.5、5.0、7.5、10.0 ml的苯甲酸溶液(1.095×10-4g/ml)，定容至刻度，得到苯甲酸與樣品體積比分別為0.5、1.0、1.5、2.0。置于35 ℃水中加熱15 min后測(cè)試熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以熒光強(qiáng)度值(y) 對(duì)維生素C濃度(x)作圖得出回歸方程為：y= 1 704x+8.219，R2= 0.989。結(jié)果表明，維生素C-苯甲酸體系在1.00×10-4～5.05×10-4g/ml的范圍內(nèi)與其熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.2 測(cè)定條件的選定

2.2.1pH對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。在pH 3.85、6.00、6.55、7.00、7.60、8.05、9.11條件下，用熒光計(jì)測(cè)定溶液熒光強(qiáng)度分別為：3.742 5、21.440 4、40.361 0、44.169 0、38.740 0、20.632 0、3.704 2。由此可見(jiàn)，在相同條件下，熒光強(qiáng)度會(huì)隨緩沖液pH的增大而增大，到一定程度后，熒光強(qiáng)度會(huì)隨緩沖液pH的增大而減小，即pH=7.00時(shí)，體系熒光強(qiáng)度最大，所以將緩沖液pH=7.00確定為最佳測(cè)定酸堿度。

2.2.2溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。將“1.2.2.2”中配制的反應(yīng)體系分別置于溫度為20、35、40、45、55、65 ℃的水中加熱15 min后測(cè)定其熒光強(qiáng)度分別為：17.390、28.664、18.611、18.515、17.048。

由此可見(jiàn)，在相同條件下，熒光強(qiáng)度會(huì)隨溫度的增大而增大，到一定程度后，熒光強(qiáng)度會(huì)隨溫度的增大而減小，即溫度為35 ℃時(shí)，體系熒光強(qiáng)度最大，所以將反應(yīng)溫度為35 ℃確定為最佳測(cè)定溫度。

2.2.3時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。將“1.2.2.3”中配制的反應(yīng)體系分別在常溫下靜置5、10、15、20、25 min測(cè)定熒光強(qiáng)度分別為：19.371、21.033、23.015、20.401、17.857。

由此可見(jiàn)，在相同條件下，熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間的增大而增大，到一定程度后，熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間的增大而減小，即時(shí)間為15 min時(shí)，體系熒光強(qiáng)度最大，所以將反應(yīng)時(shí)間為15 min確定為最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.2.4苯甲酸對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。將“1.2.2.4”中得到的苯甲酸與樣品體積比分別為0.5、1.0、1.5、2.0置于35 ℃水中加熱15 min后測(cè)試熒光強(qiáng)度分別為：18.794、18.572、23.126、21.383。

由此可見(jiàn)，在相同條件下，熒光強(qiáng)度隨苯甲酸與樣品體積之比的增大而增大，到一定程度后，熒光強(qiáng)度隨苯甲酸與樣品體積之比的增大而減小，即體積比為1.5時(shí)，體系熒光強(qiáng)度最大，所以將苯甲酸與樣品體積之比1.5確定為最佳測(cè)定條件。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果由已進(jìn)行的4個(gè)單因素試驗(yàn)，根據(jù)響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)原理[5-8]，選擇pH(X1)、溫度(X2)、時(shí)間(X3)和苯甲酸(X4)作為響應(yīng)面優(yōu)化的考察因素，以待測(cè)液維生素C的熒光強(qiáng)度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

2.4 建立模型以及顯著性檢驗(yàn)利用響應(yīng)面軟件對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次線性回歸擬合，得到數(shù)學(xué)模型為：Y=-786.183 70+203.275 83X1+1.688 25X2+2.494 15X3+41.791 67X4+4.000 000E-003X1X2-5.500 00E-003X1X3+0.182 50X1X4-1.112 50E-003X2X3-2.500 00E-004X2X4+5.250 00E-003X3X4-14.565 83X12-0.024 190X22-0.081 321X32-7.162 08X42。對(duì)模型進(jìn)行回歸分析得：F模型=1 153.77，F(xiàn)X1=0.17，F(xiàn)X2=1.27，F(xiàn)X3=0.53，F(xiàn)X4=2.87，F(xiàn)X1X2=0.22，F(xiàn)X1X3=0.10，F(xiàn)X1X4=1.15，F(xiàn)X2X3=1.70，F(xiàn)X2X4=8.604E-004，F(xiàn)X3X4=0.095，F(xiàn)X12=11 840.24，F(xiàn)X22=5 224.76，F(xiàn)X32=3 690.57，F(xiàn)X42=2 862.65，F(xiàn)失擬=1.44;P模型<0.000 1,PX1=0.684 5,PX2=0.279 0,PX3=0.478 5,PX4=0.112 5,PX1X2=0.646 1,PX1X3=0.751 7,PX1X4=0.302 5,PX2X3=0.212 8,PX2X4=0.977 0,PX3X4=0.762 6,PX12<0.000 1,PX22<0.000 1,PX32<0.000 1,PX42<0.000 1,P失擬=0.387 7。

試驗(yàn)確定出測(cè)定維生素C最佳工藝條件為pH為7.0，溫度為37.13 ℃，時(shí)間為14.95 min，苯甲酸為7.51 ml。

2.5 響應(yīng)面分析及優(yōu)化圖1、2是Y=(X1,X2)和Y=(X1,X3)等高線和響應(yīng)面圖，Y=(X1,X4)、Y=(X2,X3)、Y=(X2,X4)、Y=(X3,X4)的等高線和響應(yīng)面圖略。由此確定出測(cè)定維生素C最佳工藝條件為pH=7，溫度=37.13 ℃，時(shí)間為14.95 min，苯甲酸為7.51 ml。

2.6 樣品中維生素C的含量測(cè)定取3個(gè)50 ml容量瓶，分別加入5.0 ml檸檬味脈動(dòng)飲品、10.0 ml緩沖液及7.5 ml苯甲酸溶液，定容至刻度并搖勻。將其放入35 ℃的水中加熱15 min后測(cè)定熒光強(qiáng)度并計(jì)算維生素C含量。在選定波長(zhǎng)下，測(cè)得其熒光強(qiáng)度分別為40.341、39.882、40.454，體系中維生素C含量為0.018 86、0.018 58、0.018 92 mg/ml，平均值為0.018 78 mg/ml，即樣品中維生素C的含量為0.187 8 mg/ml。

2.7 方法評(píng)價(jià)

2.7.1回收率試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱(chēng)取維生素C標(biāo)準(zhǔn)品0.021 0 g,溶解后移入100 ml容量瓶中，得到2.10×10-4g/ml的維生素C儲(chǔ)備液備用。取6個(gè)50 ml容量瓶，分別加入5.0 ml維生素C儲(chǔ)備液。然后向1、2瓶中移入0.5 ml、3、4瓶中移入1.0 ml、5、6瓶中移入1.5 ml維生素C樣品液。再各加入10.0 ml緩沖液及加入8.25、8.25、9.00、9.00、9.75、9.75 ml苯甲酸溶液，在最佳條件下測(cè)定。計(jì)算回收率如表3所示。

由表3可以看出，該試驗(yàn)回收率在97.75%～98.97%，說(shuō)明該試驗(yàn)的準(zhǔn)確性較好，測(cè)定結(jié)果可信性強(qiáng)。

表3 熒光法回收率試驗(yàn)

2.7.2精密度試驗(yàn)。從維生素C標(biāo)準(zhǔn)液中分別精密吸取5.0 ml于50 ml容量瓶中，各加入10.0 ml緩沖液及7.5 ml苯甲酸定容，置于35 ℃水中加熱，在相同條件下連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算得RSD為3.4%。表明測(cè)定結(jié)果的精密度良好。

2.7.3重現(xiàn)性試驗(yàn)。在確定的最佳試驗(yàn)條件下，配制相同濃度的樣品溶液6份，利用熒光計(jì)測(cè)定并計(jì)算RSD為2.4%。由此說(shuō)明該試驗(yàn)的重現(xiàn)性較好，測(cè)定結(jié)果的可信度較高。

2.7.4穩(wěn)定性試驗(yàn)。在確定的最佳試驗(yàn)條件下，對(duì)同一個(gè)樣品在一定時(shí)間范圍內(nèi)用熒光計(jì)每隔15 min測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定6次得RSD為2.8%。由此說(shuō)明測(cè)定儀器穩(wěn)定性較好。

3 討論

3.1 單因素的探討由于苯甲酸為熒光底物，因此苯甲酸的用量要列為單因素條件。維生素C不穩(wěn)定性，溫度和pH應(yīng)列為單因素。對(duì)于反應(yīng)時(shí)間的問(wèn)題，是將溶液在常溫下反應(yīng)過(guò)后，再進(jìn)行水浴調(diào)溫，還是直接在水浴下反應(yīng)，進(jìn)行了探討性試驗(yàn)，選擇在水浴時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。

3.2 測(cè)定方法的討論從試驗(yàn)結(jié)果看，在相同的條件下連續(xù)熒光測(cè)定6次，得出RSD為3.4%，結(jié)果表明精密度良好。配制相同濃度的樣品溶液，在相同條件下每隔15 min測(cè)定一次，得到的RSD為2.8%，說(shuō)明樣品溶液體系較穩(wěn)定。從而確定熒光分析法適用于低含量維生素C的測(cè)定。

3.3 數(shù)據(jù)處理方法的評(píng)價(jià)該試驗(yàn)使用響應(yīng)面優(yōu)選法優(yōu)化試驗(yàn)條件更具科學(xué)性、嚴(yán)謹(jǐn)性。優(yōu)選得到的測(cè)定工藝條件科學(xué)合理，可信度高。

[1] 章麗，佘世科，高峰.一種新型環(huán)糊精衍生物的制備及熒光法測(cè)定抗壞血酸[J].分析化學(xué)，2005(11):1583-1584.

[2] 孫振艷，趙中一，郭小慧，等.熒光分析法測(cè)定維生素C[J].中國(guó)地質(zhì)大學(xué)材料化學(xué)工程學(xué)報(bào)，2006，25(4):18-20.

[3] 于小萍.分光光度法快速測(cè)定蔬菜水果中維生素C的含量[J].揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，6(2):16-18.

[4] 蔣水星，陳雪峰，趙天殊.響應(yīng)面法優(yōu)化大棗多糖的提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(6):4-5.

[5] 李國(guó)棟，孫宗保.利用響應(yīng)面法優(yōu)化HS-SPME鎮(zhèn)江香醋香氣成分的條件[J].中國(guó)釀造，2009(8):13-14.

[6] 張秀紅,孫靜超,李琪.響應(yīng)面法優(yōu)化茉莉花茶茶多糖提取工藝[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2010(3):3-5.

[7] 王巧英,吳冬青,安紅鋼,等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化抑制-褪色光度法測(cè)定維生素C的條件[J].食品工業(yè)科技,2011(11):14-16.

[8] 魏紅福,王志江.響應(yīng)面法優(yōu)化木蹄多糖提取工藝研究[J].化學(xué)工程與裝備,2009(9):11-2312.

Study on Technique Conditions of Determination of Vitamin C by Fluorescent Response Surface Method

ZHANG Ding, CHEN Shuai, GAO Shu-yun*

(Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou, Jiangsu 221008)

[Objective] Accoding to characteristics of fluorescent substance produced by reaction of Benzoic acid and vitamin C, a method for measuring vitamin C content was established. [Method] Using sodium hydroxide-potassium hydrogen phthalate as buffer solution to adjust pH, through the measurement of sample pre-treatment time, temperature, amount of acid buffer solution and pH test to determine the best univariate single factor levels and response surface optimization of the experimental method to determine the optimum conditions to promote benzoic acid as a fluorescent substance in vitamin C drinks. [Result] Benzoic acid to vitamin C to promote fluorescence evident in the fluorescence intensity of the excitation wavelength of 310 nm, 410 nm emission wavelength measured its products. Vitamin C concentration in the 1.00×10-4～ 5.05×10-4g/ml scope of its fluorescence intensity was good linear relationship, the lower limit of detection, the correlation coefficient was 0.989. [Conclusion] The result of determining vitamin C content in drink is accurate by fluorescence, the method is feasible.

Vitamin C; Fluorescence analysis; Benzoic acid; Response surface method

張 鼎(1991-)男，江蘇揚(yáng)州人，從事生物檢測(cè)工藝研究。*通訊作者，教授，碩士，從事食品及天然植物有效成分分離及檢測(cè)研究。

2014-10-08

S 609.9

A

0517-6611(2015)01-254-03