黑木耳多糖的制備及其抗凝血功能的研究

李德海， 史錦碩， 周 聰， 孫宏偉， 王振宇

(1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱 150086)

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黑木耳多糖的制備及其抗凝血功能的研究

李德海1， 史錦碩1， 周 聰1， 孫宏偉1， 王振宇2*

(1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱 150086)

[目的] 探討黑木耳多糖的制備并研究其抗凝血功能。[方法] 采用水、酸溶液及堿溶液對黑木耳多糖進行提取制備，并以APTT、PT、TT 3個體外抗凝血指標為衡量依據，分別對其抗凝血功能進行了研究。[結果]試驗表明，水溶性黑木耳多糖的提取率最高，而堿溶性多糖的純度最高，且除蛋白后多糖純度高于除蛋白前，可達到83.05%。抗凝血試驗表明，水溶性、酸溶性和堿溶性3種黑木耳多糖均能顯著延長家兔血漿的APTT(P<0.01)，而對PT和TT無明顯影響(P>0.01)，并且APTT的值與多糖濃度呈正相關。多糖對APTT的作用強弱順序為堿溶性>水溶性>酸溶性，且除蛋白后的多糖對APTT的作用效果均高于除蛋白前。[結論] 研究可為黑木耳多糖在抗凝血臨床方面的應用提供參考依據。

黑木耳多糖；制備；抗凝血

黑木耳又名叫木耳、云耳等，是一種非常珍貴的并且具有食用價值和藥用價值的膠質真菌[1]，主要生長在我國的東北三省以及湖北、福建、四川、廣東、山東、貴州、云南等省份。在藥用價值方面，我國醫學歷來認為黑木耳也是一種藥用價值較高的藥用菌，也是目前公認的可食性保健品，其子實體具有清肺益氣、滋潤補血、止痛鎮定、活血化瘀的功效，也被用于治療血管硬化、高血壓、子宮出血、便秘等。研究表明，黑木耳多糖還具有抗氧化[2]、抗凝血[3]、抗腫瘤[4]、抗衰老[5]、降血糖[6]、降血脂[5]等作用。目前已有一些報告證明其確實具有抗凝血功效，筆者以APTT、PT、TT 3個體外抗凝血指標為衡量依據，分別測定酸溶液、堿溶液和蒸餾水提取的黑木耳多糖的抗凝血功效，并討論除蛋白對該生理功效的影響，從而篩選出抗凝血效果最好的一種黑木耳多糖，為黑木耳多糖在抗凝血臨床方面的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料天然野生黑木耳由黑龍江省大興安嶺興安有機食品有限公司提供。試驗中所用試劑均為分析純。肝素鈉由solarbio公司提供，效價≥140 U/mg；活化部分凝血活酶時間(APTT)測定試劑盒(白陶土，凝固法)、凝血酶原時間(PT)測定試劑盒(凍干型，凝固法)、凝血酶時間(TT)測定試劑盒(凝固法)由上海太陽生物技術有限公司提供。

TGL-16G臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；722s分光光度計，上海第三分析儀器廠；JA2003分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽，鞏義市予華儀器有限責任公司；RE-52旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器公司；Finnpipette移液槍，美國Thermo Lab-system公司；FM-100粉碎機，日本1watani公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇榮華儀器制造有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1黑木耳多糖的提取及制備。將市購的黑木耳除雜、粉碎，過60目篩，用3倍體積的石油醚浸泡24 h進行脫脂處理。

準確稱取脫脂后的黑木耳干粉，分別按料液比1∶100 g/ml加入蒸餾水、0.1 mol/L的HCl和NaOH溶液后，于90 ℃的水浴中浸提4 h，提取液以4 000 r/ min離心10 min。然后采用H2O2脫色法對得到的黑木耳多糖進行脫色處理，測定并記錄其多糖含量。

將得到的3種黑木耳多糖溶液分別分為2份，一份經旋轉濃縮后采用糖液3倍體積的無水乙醇醇沉，過濾，冷凍干燥成粉，用于不除蛋白的活性研究；另一份采用Sevage法除蛋白后，將得到的上清液旋轉濃縮后同樣采用糖液3倍體積的無水乙醇醇沉，過濾，冷凍干燥成粉，用于除蛋白后的活性研究。

1.2.2多糖含量的測定。該試驗采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。

1.2.2.1標準曲線的繪制。用分析天平準確稱取40 mg經干燥恒重的葡萄糖粉末，用蒸餾水溶解并定容至500 ml容量瓶中。然后準確吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 ml的葡萄糖標準溶液，再補加蒸餾水至2.0 ml。以蒸餾水做空白對照。分別加入1.0 ml的6%的苯酚溶液和5.0 ml的濃硫酸溶液，靜止10 min，搖勻。再在室溫條件下放置20 min。然后在波長490 nm處測定其吸光值。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線(圖1)。回歸方程：Y=-0.001 8+0.011 2X。

1.2.2.2多糖含量的測定。準確吸取2.0 ml多糖溶液，然后加入1.0 ml的6%的苯酚溶液和5.0 ml的濃硫酸溶液，靜止10 min，搖勻。再在室溫條件下放置20 min。然后在波長490 nm處測定其吸光值，按下面的公式可計算出溶液中的多糖含量。

式中，V為所測溶液體積(ml)；Y為吸光值。

1.2.3黑木耳多糖抗凝血作用的評價。以活化部分凝血活

酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)3個體外抗凝血指標作為檢測指標，對不同溶液提取所獲多糖的抗凝血效果進行研究。動物混合血漿的制備：選擇成年健康家兔，心臟取血，用 0.109 mol/L 檸檬酸鈉抗凝(體積比10∶1)，3 000 r/min 離心15 min，取上清血漿備用。分別準確吸取6種不同的黑木耳多糖樣品與已制備好的成年家兔血漿以1∶4的體積比混勻成待測血漿，然后以等量的0.002 6 mg/ml肝素鈉代替樣品作為陽性對照組，以等量的生理鹽水(0.9%)代替待測樣品作為陰性對照組。APTT、PT、TT 3個指標的測定方法參照試劑盒說明書。

2 結果與分析

2.1 不同溶液浸提黑木耳多糖得率的比較分別用蒸餾水、酸溶液、堿溶液提取黑木耳多糖，并分別設除蛋白前組及除蛋白后組，測定幾種多糖的得率及多糖純度結果如表1所示。

表1 不同溶液對黑木耳多糖提取影響的比較 %

由表1可知，水溶性黑木耳多糖得率最高，堿溶性次之，酸溶性最低，其得率分別為18.55%、15.34%、10.38%。而多糖純度由大到小依次為：堿溶性黑木耳多糖、水溶性黑木耳多糖、酸溶性黑木耳多糖，且除蛋白后多糖純度高于除蛋白前。

2.2 不同溶液提取黑木耳多糖抗凝血的分析

2.2.1黑木耳多糖抗凝血功能性的研究。配制10 mg/ml的多糖溶液進行黑木耳多糖抗凝血功能的初步研究。家兔血漿中分別加入6種黑木耳多糖后，3項凝血指標(APTT、PT、TT)的測定結果如表2所示。

表2 黑木耳多糖抗凝血研究

注：表中數據為平均值±標準差(其中n=3)，試驗組數均為3；與陰性對照組相比較，**表示P<0.01。

由表2可以看出，與生理鹽水陰性對照組相比，6種黑木耳多糖對APTT有顯著的延長作用(P<0.01)，而對PT及TT均無明顯作用(P>0.01)。醫學上根據凝血現象的觸發機理的不同，將凝血過程劃分為外源性凝血機制和內源性凝血機制。APTT、TT和PT是各自獨立的基礎性凝血途徑篩查指標，APTT反映內源性凝血系統的活性，PT反映外源性凝血途徑的指標[7]。分析該試驗結果表明，黑木耳多糖主要通過內源性凝血機制發揮其抗凝血作用。這與申建和等在黑木耳多糖、銀耳多糖、銀耳孢子多糖的抗凝血作用中的體內抗凝血試驗研究結果相一致，主要差別在于該試驗研究的是黑木耳多糖的體外抗凝血[8]。故后續試驗選取APTT作為抗凝血檢測指標。

2.2.2不同濃度水溶性黑木耳多糖對兔血漿APTT的影響。分別選取2、6、10 mg/ml 3個濃度梯度的水溶性黑木耳多糖溶液與兔血漿混合，測定其APTT的值，并對比除蛋白處理對APTT的影響，結果見表3。

表3 水溶性黑木耳多糖對APTT的影響

注：表中數據為平均值±標準差(其中n=3)，試驗組數均為3。

由表3可以看出，與陰性對照組相比，3種濃度的水溶性黑木耳多糖對兔血漿的APTT值均有顯著延長效果(P<0.01)，但其APTT值仍均低于陽性對照組。同時可以看出，兔血漿的APTT值隨水溶性黑木耳多糖濃度的增大而增大，并且經過除蛋白處理的多糖其兔血漿的APTT值高于同濃度未除蛋白的多糖。

2.2.3不同濃度酸溶性黑木耳多糖對兔血漿APTT的影響。分別選取2、6、10 mg/ml 3個濃度梯度的酸溶性黑木耳多糖溶液與兔血漿混合，測定血漿的APTT值，對比多糖除蛋白前后對APTT的影響，結果如表4所示。

表4 酸溶性黑木耳多糖抗凝血作用分析

注：表中數據為平均值±標準差(其中n=3)，試驗組數均為3組。

由表4可以看出，與陰性對照組相比，除2 mg/ml未除蛋白的酸溶性黑木耳多糖的血漿APTT沒有顯著延長(P>0.05)以外，其他較高濃度及2 mg/ml的除蛋白后的酸溶性多糖均可以顯著延長血漿的APTT(P<0.01)。但該試驗3種濃度的酸溶性多糖的血漿APTT值均小于陽性對照組。從表4中還可看出，APTT的值與多糖濃度呈正相關。并且加入除蛋白后多糖的血漿APTT值均高于加入同濃度未除蛋白多糖的。

2.2.4不同濃度堿溶性黑木耳多糖對兔血漿APTT的影響。同樣選取2、6、10 mg/ml 3個濃度梯度的堿溶性黑木耳多糖溶液與兔血漿混合，測定血漿的APTT值，并對比多糖除蛋白前后對APTT的影響，結果如表5所示。

表5 堿溶性黑木耳多糖抗凝血作用分析

注：表中數據為平均值±標準差(其中n=3)，試驗組數均為3組。

由表5可以看出，相比于陰性對照組，3種不同濃度的堿溶性黑木耳多糖均可以顯著延長血漿的APTT(P<0.01)，尤其是10 mg/ml除蛋白后的堿溶性黑木耳多糖，使血漿的APTT延長至陰性對照組的4倍左右，已與0.002 6 mg/ml的肝素鈉陽性對照組取得了相當的抗凝血效果。并且從數據中可以看出，APTT隨多糖濃度的增大而延長。對于經過除蛋白處理的堿溶性多糖，濃度為10 mg/ml時血漿的APTT比濃度為2 mg/ml時延長了近2倍。同時可看出，除過蛋白的多糖其血漿的APTT值大于同濃度未除蛋白多糖的。

綜合表3、4、5可以看出，水溶性、酸溶性和堿溶性黑木耳多糖相比于陰性對照組，均使血漿的APTT顯著延長(P<0.01)。并且在試驗范圍內，APTT的值與多糖濃度呈正相關，說明黑木耳多糖的抗凝血功效在一定范圍內有一定的劑量依賴性，這與王辰龍等的研究結果相一致[9]。其中堿溶性黑木耳多糖對APTT的延長效果最明顯，其次為水溶性黑木耳多糖，酸溶性黑木耳多糖最弱；而對于同一種溶液提取的黑木耳多糖來說，其除蛋白前后對APTT的延長效果也有顯著差別，除蛋白后的多糖對APTT的延長效果均高于除蛋白前。推測可能是由于除蛋白時除去了黑木耳粗多糖中游離的蛋白質，使其單位作用面積上的多糖濃度大大提高，因此使得其抗凝血效果得到了顯著性的增加。

3 結論

3.1 黑木耳多糖的提取黑木耳多糖經不同pH的溶液提取，其提取率存在著明顯的差異性。其中水溶性黑木耳多糖的提取率最高，約為18.55%，其次為堿溶性黑木耳多糖15.34%，酸溶性黑木耳多糖最低，約為10.38%；多糖含量關系為：堿溶性>水溶性>酸溶性，且除蛋白后多糖含量高于除蛋白前。

3.2 黑木耳多糖的抗凝血性該試驗提取得到的水溶性、酸溶性和堿溶性黑木耳多糖相比于陰性對照均對APTT有明顯的延長效果，并且這種效果在一定范圍內有一定的劑量依賴性，而對PT和TT值無明顯影響。不同溶液提取的黑木耳多糖對APTT的延長效果強弱順序為：堿溶性>水溶性>酸溶性；并且除蛋白處理可以在一定程度上提高其該功效。因此綜合多糖提取率和含量考慮可得出，經除蛋白處理的堿溶性黑木耳多糖最適合作為一種天然抗凝血活性成分進行更進一步的研究。

以上結論為黑木耳多糖在抗凝血方面的應用奠定了基礎，其具體抗凝血機制還有待進一步的研究。

[1] 王振宇,張寧,趙鑫.酸溶性黑木耳多糖抗氧化性研究[J].中國林副特產,2011(3)：4-6.

[2] 趙鑫.黑木耳分級多糖抗氧化活性及其相關生理功能研究[D].哈爾濱：東北林業大學，2011.

[3] 樊一橋,武謙虎,盛健惠.黑木耳多糖抗血栓作用的研究[J].中國生化藥物雜志,2009,30(6)：410-412.

[4] 平兆華，許小娟，張俐娜，等.黑木耳β-葡聚糖抗腫瘤活性研究[R].上海：全國高分子學術論文報告會，2013.

[5] 周國華.黑木耳多糖抗衰老及降血脂生物功效的研究[D].哈爾濱：東北農業大學，2005.

[6] 韓春然,馬永強,唐娟.黑木耳多糖的提取及降血糖作用[J].食品與生物技術學報,2006,25(5)：111-114.

[7] 徐美玲,孫黎明,周大勇，等.皺紋盤鮑性腺多糖體外免疫活性和抗凝血活性的研究[J].水產科學,2009,28(9)：498-500.

[8] 申建和,陳瓊華.黑木耳多糖、銀耳多糖、銀耳抱子多糖的抗凝血作用[J].中國藥科大學學報,1987,18(2)：137-140.

[9] 王辰龍,張子奇,王曼，等.黑木耳多糖的提取分離及體外抗凝血作用研究[J].食品工業科技,2013(9)：238-241.

Preparation of Polysaccharides fromAuriculariaauricularand Analysis of Their Anticoagulant Function

LI De-hai1, SHI Jin-shuo1, ZHOU Cong1, WANG Zhen-yu2*et al

(1. College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; 2. College of Food Science and Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin, Heilongjiang 150086)

[Objective] To discuss the preparation of polysaccharides fromAuriculariaauricular, and study its anticoagulant function. [Method] Water, acid solution and alkaline solution were used to extract the polysaccharides fromAuriculariaauricular. With APTT, PT, TT as basis, its anti-clotting function was studied. [Result] The results showed that the water-soluble polysaccharides fromAuriculariaauricularhad the highest extraction rate, while the alkali-soluble polysaccharide had the highest purity, and the purity of the polysaccharide which had protein removed was higher than those hadn’t, reaching 83.05%. The results showed that three kinds of polysaccharides fromAuriculariaauricularcan significantly prolong rabbits plasma APTT (P<0.01), whereas no significant effect on PT or TT (P>0.01). The value of APTT and polysaccharide concentrations were positively correlated. The order of the effect which Polysaccharides took on APTT was alkali-soluble> water-soluble> acid soluble. In addition, removal of protein can increase the effect on APTT. [Conclusion] The study can provide reference basis for application ofAuriculariaauricularpolysaccharides in anticoagulant.

Polysaccharides fromAuriculariaauricular; Preparation;Anticoagulant

黑木耳即食產品開發關鍵技術研究項目(GA13B202)；中央高校基本科研業務費專項資金項目(2572014CA19)。

李德海 (1976- )，男，山東茌平人，副教授，碩士生導師，從事食品化學及植物有效成分研究。*通訊作者，教授，博士，博士生導師，從事天然產物分離與功能性食品開發研究。

2014-11-24

S 646.6

A

0517-6611(2015)02-283-03