棉花不同組織DNA的不同提取方法比較

朱威龍， 閆 碩， 石冀哲， 吳鳳明， 李 貞， 張青文， 劉小俠

(中國農業大學昆蟲系，北京 100193)

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棉花不同組織DNA的不同提取方法比較

朱威龍， 閆 碩， 石冀哲， 吳鳳明， 李 貞， 張青文， 劉小俠*

(中國農業大學昆蟲系，北京 100193)

[目的] 研究棉花不同組織DNA 提取的最佳方法。[方法]以棉花嫩葉、種子、黃化苗作為研究對象，比較CTAB法、SDS法、SDS-CTAB法提取DNA的效果。[結果]若對DNA的量沒有要求，棉花嫩葉、種子、黃化苗等組織均應選用SDS-CTAB法提取DNA。若對DNA的量有一定要求，如濃度需大于100 ng/μl，質量大于20 000 ng的情況下，針對不同試驗材料推薦使用的提取方法是：棉花嫩葉用CTAB法，棉花種子SDS法，棉花黃化苗CTAB法。[結論] 為快速高通量地檢測轉基因棉花基因漂移距離和頻率提供參考。

棉花；嫩葉；種子；黃化苗；CTAB；SDS；SDS-CTAB

棉花是我國最重要的經濟作物之一，2013年我國棉花種植面積達到472.06萬hm2，產量達到667.8萬t[1]，其中轉基因棉花種植面積為420萬hm2[2]。隨著Bt棉的大規模種植，基因漂移問題也成為學術界關注的熱點。轉基因作物中的外源基因可能會漂移到野生近緣種或雜草中，最終給農業生產和生態環境帶來負面影響。轉基因作物的大量釋放很有可能增加農業生態系統的選擇壓力，甚至破壞原有物種之間的平衡關系[3-4]。因此，轉基因棉花的安全性評價是十分必要的，而對其基因漂移的頻率和距離進行檢測有賴于對樣品DNA的提取。有關棉花的研究多集中于分子輔助育種和基礎生物學等方面，而其分子標記和基礎生物學研究明顯滯后于水稻、玉米、油菜等其他作物，主要原因是其DNA的提取和純化較其他作物更困難[5-6]。棉花富含棉酚、多糖、單寧、蛋白等次生代謝物質，這些次生代謝物易形成與核酸的復合物，影響所提取DNA的質量[7]。

提取棉花DNA的方法主要有CTAB法[5,8]、SDS法[9-13]、SDS-CTAB法[7]。該試驗將棉花黃化苗作為研究對象之一，以期降低蛋白質對DNA提取的影響，并在次生代謝物大量累計之前提取棉花DNA，探究其是否對棉花DNA的提取存在有利的影響。筆者以棉花種子、嫩葉為研究對象，找出棉花不同組織DNA的最佳提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料轉基因抗蟲抗除草劑棉花(中國農業科學院棉花研究所提供)的種子、嫩葉、黃化苗，非轉基因棉花石遠321。

1.2 DNA提取緩沖液及其成分CTAB提取緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl, 20 mmol/L EDTA, 2%CTAB(W/V), 2%PVP40(W/V), 8%NaCl(W/V), 2%β-巰基乙醇(W/V)。SDS提取緩沖液：1% SDS, 10 mmol/L EDTA, 8%NaCl(W/V), 50 mmol/L Tris-HCl, 0.5%山梨醇, 1%PVP40(W/V), 2%β-巰基乙醇(W/V)。TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA。

其他試劑：氯仿∶異戊醇(24∶1)，70%乙醇，無水乙醇，異丙醇，5 mol/L KAc。

1.3 DNA提取方法將棉花種子種于基質(草炭∶蛭石=3∶1)中，未遮光處理得到棉花嫩苗，遮光處理得到棉花黃化苗。取棉花嫩葉圓片約1 cm2(約33.69 mg)，棉種約1/4(約19.29 mg)，棉花黃化苗圓片約1 cm2(約25.62 mg)。最后根據測出的DNA濃度計算得率：得率(ng/mg)=濃度(ng/μl) X 200(μl) /質量(mg)。

1.3.1CTAB法。參照宋國立等[5]的方法并稍加改動，步驟如下：將稱量好的試驗材料置于2 ml離心管底部，加入小鋼珠，敞開管蓋放入冷凍干燥儀，冷凍干燥24 h后迅速放入球磨儀中振蕩研磨35 s(30Times/s)。然后加入經65 ℃預熱的800 μl CTAB提取液，置于振蕩器上約30 s，放入65 ℃水浴中40 min，每隔10 min上下顛倒1次。水浴后加入800 μl氯仿∶異戊醇(24∶1)，上下輕搖混勻約10 min，10 000 r/min離心10 min。取上清(約600 μl)至1.5 ml離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)重提一次，10 000 r/min離心10 min。重取上清(約500 μl)至新1.5 ml離心管中，加入2倍體積(約1 ml)經-20 ℃預冷無水乙醇，緩慢顛倒離心管15次以上。于-20 ℃冰浴靜置30 min以上，然后12 000 r/min離心7 min。小心傾去上清，用70%乙醇洗2次，無水乙醇洗1次，風干30 min至干燥后加入200 μl TE，4 ℃保存。

1.3.2SDS法。參照郭寶生等[12]、劉峰等[13]、匡猛等[14]的方法并稍加改動，步驟如下：將稱量好的試驗材料置于2 ml離心管底部，加入小鋼珠，敞開管蓋放入冷凍干燥儀，冷凍干燥24 h后迅速放入球磨儀中振蕩研磨35 s(30 Times/s)。然后加入經65 ℃預熱的800 μl SDS提取液，置于振蕩器上約30 s，放入65 ℃水浴中40 min，每隔10 min上下顛倒1次。水浴后加入800 μl氯仿∶異戊醇(24∶1)，上下輕搖混勻約10 min，10 000 r/min離心10 min。取上清(約600 μl)至1.5 ml離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)重提一次，10 000 r/min離心10 min。重取上清(約500 μl)至新1.5 ml離心管中，加入2倍體積(約1 ml)經-20 ℃預冷異丙醇，緩慢顛倒離心管15次以上。于-20 ℃冰浴靜置30 min以上，然后12 000 r/min離心7 min。小心傾去上清，用70%乙醇洗2～3次，無水乙醇洗1次，風干30 min至干燥后加入200 μl TE，4 ℃保存。

1.3.3SDS-CTAB。參照孫鑫等[7]的方法并稍加改動，步驟如下：將稱量好的試驗材料置于2 ml離心管底部，加入小鋼珠，敞開管蓋放入冷凍干燥儀，冷凍干燥24 h后迅速放入球磨儀中振蕩研磨35 s(30 Times/s)。然后加入經65 ℃預熱的600 μl SDS提取液，置于振蕩器上約30 s，于65 ℃水浴40 min。加入200 μl 5 mol/L KAc混勻，冰浴30 min，4 ℃離心，12 000 r/min，10 min。取上清，加入200 μl CTAB提取液，充分混勻，65 ℃水浴20 min。加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提2次，室溫離心10 000 r/min，10 min。取上清，加入-20 ℃預冷的異丙醇1 000 μl，緩慢顛倒離心管15次以上。于-20 ℃冰浴靜置30 min以上，然后12 000 r/min離心7 min。小心傾去上清，用70%乙醇洗2～3次，無水乙醇洗1次，風干30 min至干燥后加入200 μl TE，4 ℃保存。

1.4 DNA的質量檢測。

1.4.1紫外分光光度法檢測。以TE作為空白對照，利用微量紫外分光光度計(Nanodrop2000, Thermo Scientific)檢測所提取棉花DNA的濃度、OD260/280，并根據提取DNA前稱量的質量計算得率。其中OD260/280應在1.8～2.2符合要求。

1.4.2PCR及電泳檢測

1.4.2.1DNA模板稀釋。因PCR使用DNA模板2 μl，同時需要保證PCR反應體系內DNA的含量介于20～50 ng，該試驗用TE對DNA樣本統一稀釋至30 ng/μl，置于-20 ℃保存待用。

1.4.2.2DNA樣品的PCR擴增和電泳檢測。由于所選棉花材料都是轉基因抗蟲抗除草劑棉花品種，故選用特異性引物對樣品內CryⅠA(c)基因進行PCR定性檢測。上下游引物分別為5′GAAGGATTGAGCAATCTCTAC 3′和5′CAATCAGCCTAGTAAGGTCGT 3′[4]。 PCR反應體系：2×TaqPCR Master Mix 10 μl(北京強欣博瑞生物技術有限公司)，上下游引物(10 μ/mol)各0.5 μl(上海生工生物技術有限公司)，DNA模板2 μl，ddH2O 7 μl。

反應程序：預變性95 ℃4 min，變性94 ℃ 1 min、退火56 ℃ 1 min、延伸72 ℃ 1.5 min，30個循環，循環結束后總延伸72 ℃ 5 min，4 ℃保存。擴增基因CryⅠA(c)的目的片段約為340 bp，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測[15]。

2 結果與分析

2.1 DNA濃度的比較對于棉花嫩葉而言，獲得DNA濃度最高的方法是CTAB法，SDS法平均濃度達到197 ng/μl以上；對于棉花種子而言，獲得DNA濃度最高的方法是SDS法，CTAB法平均濃度達到294 ng/μl以上；對于棉花黃化苗而言,獲得DNA濃度最高的方法是SDS法，CTAB法平均濃度達到205 ng/μl以上。這3種材料提取DNA濃度最低的都是SDS-CTAB法，其平均值都低于101 ng/μl(表1)。

對于3種材料的濃度最高值而言：棉花種子(SDS法)>棉花黃化苗(SDS法)>棉花嫩葉(CTAB法)。

對所有試驗材料所有方法而言，濃度排在前3位的方法是棉花種子(SDS法)、棉花黃化苗(SDS法)、棉花嫩葉(CTAB法)。

表1 不同方法提取不同材料DNA的濃度比較

2.2 DNA的OD260/280比較對于棉花嫩葉和棉花黃化苗而言，所有方法的OD260/280都在1.8～2.2；對于棉花種子而言，只有SDS-CTAB法的OD260/280在1.8～2.2，且顯著高于CTAB法和SDS法(表2)。

表2 不同方法提取不同材料DNA的OD260/280比較

2.3 DNA得率的比較對于棉花嫩葉而言，獲得DNA得率最高的方法是CTAB法，SDS法平均得率達到1 280 ng/mg以上；對于棉花種子而言，獲得DNA得率最高的方法是SDS法，CTAB法平均得率達到3 160 ng/mg以上；對于棉花黃化苗而言，獲得DNA得率最高的方法是SDS法，CTAB法平均得率達到1 624 ng/mg以上。這3種試驗材料獲得DNA得率最低的都是SDS-CTAB法，其平均值都低于1 000 ng/mg(表3)。

表3 不同方法提取不同材料DNA的得率比較

對于3種試驗材料的得率最高值而言：棉花種子(SDS法)>棉花黃化苗(SDS法)>棉花嫩葉(CTAB法)。

對所有試驗材料所有方法而言，得率排在前3位的方法是棉花種子(SDS法)、棉花黃化苗(SDS法)、棉花種子(CTAB法)。

2.4 不同方法和不同材料提取棉花DNA的PCR檢測由圖1可知，不同方法提取不同材料DNA清晰程度由高到低為葉(SDS-CTAB)>種(SDS-CTAB)>黃(SDS-CTAB)>葉(CTAB)>種(SDS)>葉(SDS)>黃(CTAB)>種(CTAB)>黃(SDS)。

3 討論

(1)若后續試驗對DNA的量沒有要求，則棉花嫩葉、種子、黃化苗等組織都應選用SDS-CTAB法提取DNA；若后續試驗材料有限，或對提取DNA的量有一定要求(如濃度需大于100 ng/μl，質量大于20 000 ng等)，則這3種棉花組織都不能用SDS-CTAB法提取DNA。由于電泳圖結果不理想，以下方法不推薦作為提取棉花組織DNA的方法：棉花種子(CTAB法)、棉花黃化苗(SDS法)。

對提取DNA的量有一定要求的情況，即不考慮SDS-CTAB法：對于棉花嫩葉而言，CTAB法在DNA濃度、OD260/280、DNA得率、電泳圖清晰度方面，都明顯優于SDS 法。所以對于棉花嫩葉，在對提取DNA的量有一定要求的情況下，推薦選用CTAB法。

對于棉花種子而言，CTAB法由于電泳圖結果不理想而不被推薦使用。SDS 法雖然OD260/280較低，但DNA濃度、DNA得率非常高，且電泳圖清晰，符合試驗要求。所以對于棉花種子，在對提取DNA量有一定要求的情況下，推薦選用SDS法。

對于棉花黃化苗而言，SDS法由于電泳圖結果不理想而不被推薦使用。CTAB法在DNA濃度、OD260/280、DNA得率、電泳圖清晰度方面，都符合試驗要求，所以在對提取DNA的量有一定要求的情況下，推薦選用CTAB法。

(2)棉花黃化苗(CTAB法)提取DNA濃度較棉花嫩葉(CTAB法)和棉花種子(CTAB法)雖然略低，但由于其樣品質量較棉花嫩葉小，所以其得率與棉花嫩葉(CTAB法)沒有顯著差異，且其OD260/280在1.8～2.2，雖然其電泳圖效果符合試驗要求且清晰程度優于棉花種子(CTAB法)，但不如棉花嫩葉(CTAB法)。

棉花黃化苗(SDS法)提取DNA濃度和得率較棉花嫩葉(SDS法)高，較棉花種子(SDS法)低，且其OD260/280在1.8～2.2，但其電泳圖清晰度不符合試驗要求且都不如棉花嫩葉和棉花種子SDS法的電泳圖清晰。

棉花黃化苗(SDS-CTAB法)提取DNA濃度較棉花嫩葉(SDS-CTAB法)和棉花種子(SDS-CTAB法)高；提取DNA得率較棉花嫩葉(SDS-CTAB法)高，與棉花種子(SDS-CTAB法)沒有顯著差異。且其OD260/280在1.8～2.2，電泳圖清晰度符合試驗要求。

雖然棉花黃化苗(SDS法)提取DNA的OD260/280在1.8～2.2，但其PCR及電泳結果不符合試驗要求；而棉花種子(SDS法)提取DNA的OD260/280不在1.8～2.2，但其PCR及電泳結果符合試驗要求。所以OD260/280與PCR及電泳結果之間沒有必然的聯系。

SDS-CTAB法濃度普遍偏低是因為在加入氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提前就已離心，大大減少了雜質對DNA純度的影響，使得提取的3種試驗材料DNA樣品的OD260/280平均都在2.0以上。但這一步離心也使得部分DNA被當作沉淀棄掉，導致SDS-CTAB法提取的DNA濃度很低。

轉基因棉花的安全性評價需要對其基因漂移的距離和頻率進行檢測，而提取棉花DNA是檢測基因漂移的必要步驟，快速高通量的提取棉花DNA并對其進行檢測有利于提高效率。專門針對提取棉花DNA的試劑盒昂貴，不適合高通量的檢測[16]，且對棉花葉子的檢測需要先在室內發苗，檢測周期長[13,17]，用棉花種子(SDS法)直接檢測可以縮短檢測周期，提高工作效率，該試驗也為快速高通量地檢測轉基因棉花基因漂移距離和頻率提供了參考。

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The Comparative Research on DNA Extraction from Different Organizations by Different Methods

ZHU Wei-long, YAN Shuo, SHI Ji-zhe, LIU Xiao-xia*et al

(Department of Entomolagy, China Agricultural University, Beijing 100193)

[Objective] The aim was to study the comparative on DNA extraction from different organizations by different methods. [Method]The materials of this research were young leaves, seeds and etiolated seedlings of cotton, the effects among methods of CTAB, SDS, SDS-CTAB were compared. [Result] According to the results, if further experiment does not have high requirement of the quantity of DNA, the method of SDS-CTAB should be applied to extracting DNA from young leaves, seeds and etiolated seedlings of cotton. If further experiment has high requirement of the quantity of D NA ( Concentration should be above 100 ng/μl. Mass should be above 20 000 ng), the best methods for different materials are that: method of CTAB for young leaves of cotton, method of SDS for seeds of cotton, method of CTAB for etiolated seedlings. [Conclusion] The study provided reference for detection of cotton.

Cotton; Young leaf; Seed; Etiolated seedling; CTAB; SDS; SDS-CTAB

轉基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08011002-006)。

朱威龍(1989- )，男，廣西柳州人，碩士研究生，研究方向：轉基因生物安全評價。*通訊作者。

2014-11-27

S 562

A

0517-6611(2015)02-016-03