鎘脅迫對不同水稻品種氮代謝關鍵酶活性和植株氮磷鉀積累的影響

黃 維，彭建偉*，龔 蓉，庹海波，范艷咪

(1.湖南農業大學資源環境學院，湖南長沙 410128；2.農田污染控制與農業資源利用湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128；3.植物營養湖南省普通高等學校重點實驗室，湖南長沙 410128；4.土壤肥料資源高效利用國家工程實驗室，湖南長沙 410128)

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鎘脅迫對不同水稻品種氮代謝關鍵酶活性和植株氮磷鉀積累的影響

黃 維1,2,3,4，彭建偉1,2,3,4*，龔 蓉1,2,3,4，庹海波1,2,3,4，范艷咪1,2,3,4

(1.湖南農業大學資源環境學院，湖南長沙 410128；2.農田污染控制與農業資源利用湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128；3.植物營養湖南省普通高等學校重點實驗室，湖南長沙 410128；4.土壤肥料資源高效利用國家工程實驗室，湖南長沙 410128)

[目的] 為了探明氮素代謝酶在水稻Cd耐性上的作用以及水稻Cd耐性的生理原因。[方法] 以不同品種的中稻為研究對象，通過盆栽試驗，探討Cd脅迫對不同水稻品種分蘗期幾種氮代謝關鍵酶活性和植株氮磷鉀積累量的差異性。[結果] 鎘脅迫能夠提高分蘗期水稻體內NPK含量，分別以深兩優5867、甬優5550和武運粳27的提高幅度最高。同時，鎘脅迫在一定程度上促進NR、GS、GOGAT 活性的提高。就NR活性而言，鎘脅迫明顯促進黃華占和甬優538 NR活性的提高，對武運粳27、深兩優5867、甬優5550影響不明顯，但相互間的差異都沒達到顯著水平。而對于GS活性，以鎘正常處理下GS活性較低的黃華占和武運粳27對鎘脅迫最為敏感，鎘脅迫促進GS活性的增加，且兩處理間差異達到0.01顯著水平，但對鎘正常處理下GS活性較高的深兩優5867和甬優5550表現出抑制作用，相互間差異不明顯。鎘脅迫下任一品種相互間GS差異并未達到顯著水平。鎘脅迫促進分蘗期水稻GOGAT活性的提高，其中以鎘正常處理下GOGAT活性最低的武運粳27的增高幅度最大。[結論]鎘脅迫會對水稻的生長發育不利，使其結實率下降，千粒重減少，導致水稻不同程度的減產。

水稻；鎘脅迫；分蘗期；氮代謝

鎘(Cadmium，Cd) 是在所有污染土壤的重金屬元素中毒性最強的重金屬之一。與其他元素相比，Cd的特殊性在于它不能被土壤微生物分解，只能在環境中遷移和轉化，具有更強的從土壤向植物遷移的能力，在環境中活性較強。同時，Cd是一種對動植物都具有毒害作用的重金屬元素，具有較高的移動性和較低的中毒濃度，對各種生物有機體具有潛在的毒性[1]。水稻是鎘吸收能力較強的作物[2]。當生長于有毒重金屬污染的土壤中時，過量的有毒重金屬在其根、莖、葉以及籽粒中大量積累，不僅嚴重影響水稻的生長發育，而且嚴重影響稻米品質。我國65%以上的人口以稻米為主食。近年來，我國稻米遭受Cd污染非常嚴重，不僅危害人們的健康[3]，而且對水稻生產的地區經濟打擊巨大，所以有關水稻Cd污染的研究意義重大[4]。Cd在自然界中的背景值較低[5]，但是隨著全國工業化的發展，“三廢”的不合理排放、固體廢棄物處理不善、污水灌溉、污泥農用以及施用含有重金屬元素的肥料等使得我國被鎘污染的稻田面積越來越多，并且有增加的趨勢[6]，促使大量的Cd被釋放進入農田生態系統，造成農田土壤中Cd含量激增，導致嚴重超標。目前我國被Cd污染的耕地約1.13 ×106hm2，覆蓋11個省市[7],每年因重金屬而減產的糧食約1 000億t，被污染的糧食達1 200億t，造成至少200億元的經濟損失[8]。由于水稻具有相對較高的鎘耐性和較易積累鎘的特性，特別是水稻植株在沒有表現出鎘毒害、產量沒有受影響時，稻米鎘積累卻已超標時表現出的隱蔽性，因此如何有效地控制稻米中鎘含量是人類社會可持續發展的關鍵[9-12]。以不同品種水稻為試驗材料，通過盆栽試驗，筆者考察其在鎘脅迫條件下氮素代謝及其相關酶活性的變化，以探明氮素代謝酶在水稻Cd耐性上的作用以及水稻Cd耐性的生理原因。

1 材料與方法

1.1 試驗設計試驗于湖南農業大學耘園教學試驗基地進行。供試土壤為第四紀紅土發育的紅黃泥，有機質含量18.669 g/kg，pH 4.73，全氮含量1.561 g/kg，堿解氮含量183.247 mg/kg，全磷含量0.634 g/kg，速效磷含量20.443 mg/kg，全鉀含量49 g/kg，速效鉀含量88 mg/kg。供試水稻有5個品種，分別為黃華占、武運粳27、深兩優5867、甬優5550和甬優538。5月27日浸種催芽后于6月12日移栽，10月7日收獲。

采用盆栽試驗，試驗設2因素5水平，共10個處理，其中2因素為鎘污染和鎘正常水平，5水平為5個水稻品種。試驗于2014年在湖南農業大學農業資源系教學實習基地玻璃網室內進行，采用盆栽試驗，選用20 cm×30 cm瓷質培養盆缽，內裝過1 cm篩的風干土6.25 kg，裝土前每千克鎘污染土壤中加入相當于1 mg鎘的CdCl2溶液，混勻，鎘正常水平的不進行加鎘處理，并將N、P、K肥作底肥一次施入，N、P2O5、K2O的施用量分別為 0.15、0.10、0.15 g/kg，重復15次，共計150盆，隨機區組排列。每缽插3蔸，每蔸3株，按常規方法進行管理。在分蘗盛期，采樣，測定，待稻谷成熟后收割、曬干、脫粒，同時按盆收獲，考種計產。

1.2 測定項目及方法

1.2.1基礎土壤。測定全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效磷、速效鉀、有機質、pH等。

1.2.2植株全氮、磷、鉀。用H2SO4-H2O2消煮，全氮用半微量凱氏定氮法測定，全磷用釩鉬黃比色法測定，全鉀用火焰光度法測定。

1.2.3氮代謝關鍵酶活性測定。

1.2.3.1硝酸還原酶(NR)。采用硝基水楊酸比色法。

單位鮮重樣品中NR活性=X×V1/(V2×W×t)

式中，X為反應液酶催化產生的亞硝態氮總量，μg；V1為提取酶時加入的緩沖液體積，ml；V2為酶反應時加入的粗酶液體積，ml；W為樣品鮮重， g；t為反應時間，h。

1.2.3.2谷氨酰胺合成酶(GS)。用Sigma公司生產的γ-谷氨?；惲u肟酸作標準曲線,測定GS活性。酶活力以每小時每克鮮樣生成的γ-谷氨?；惲u肟酸微摩爾數。

單位鮮重樣品中GS活性=X×V1/(V2×W×t)

x為反應液酶催化產生的r-谷氨?；u肟酸的總量;其余同上。

1.2.3.3谷氨酸合成酶(GOGAT)。參照 Singh 等[11]的方法，測定GOGAT活性。酶活力用每小時每克鮮樣催化氧化的NADH微摩爾數(mol/(h·g))表示。樣品在紫外分光光度計內每30 s消耗NADH的量(μg)作為一個酶活力單位。

GOGAT活性=X×V1/(V2×W×t)

式中,X為反應液酶催化30 s消耗的NADH(μg)的量;V1為提取酶時加入的緩沖液體積，ml；V2為酶反應時加入的粗酶液體積，ml；W為樣品鮮重,g；t為反應時間，30 s。

1.2.4考種與計產。考查每盆穗數、粒數、千粒重、結實率。

1.3 數據分析所有試驗數據采用Microsoft Excel 2003進行整理和作圖。不同處理間差異采取SPSS 10.0軟件進行單因素方差分析，采取LSD法進行顯著性檢驗(P<0.05)。所有結果數據均以平均值的形式來表達。

2 結果與分析

2.1 鎘脅迫對分蘗期水稻干物質累積的影響分蘗期是指植物從出苗至拔節以前的這一段時期，主要以生長根、葉、分蘗等營養器官為主，是植物一生中根系生長最旺盛和大量發展的時期，也是生殖器官開始生長發育的重要時期。就葉片來說，所有的近根葉在這一時期長出，出葉數占總葉片數3/4左右。所以，分析植株氮磷鉀的累積量對于研究植物生長走勢和生長所需元素來說至關重要。

由表1可知，鎘脅迫影響分蘗期水稻對礦質元素的吸收。從整體上說，加鎘處理對水稻分蘗期生長具有促進作用，表現為地上部分干物質累積量的增加。但是，其影響程度因不同基因型和元素種類而異。除黃華占和武運粳27外，鎘脅迫均提高了其余3個品種地上部分的氮累積量，其中深兩優5867兩處理之間差異顯著，其余4個品種氮素含量之間差異不顯著。同時，鎘脅迫減少了地上部分P的累積，但累積程度因品種而異，黃華占、武運粳27、深兩優5867在鎘脅迫下均表現為對P的干物質積累量減少，但以甬優5550的升高幅度最大，達33%。鎘脅迫對地上部分鉀累積的影響因基因類型的不同而變化，鎘脅迫減少黃華占和武運粳27對K的干物質積累量，但提高其余3個品種對K的積累量。減少或提高的幅度因基因型的不同而不同，但只有武運粳27兩處理間K積累量標線出顯著差異。

從表1還可以看出，同一處理干物質的累積量因基因型不同而表現出差異。鎘正常處理中氮素的干物質量以黃華占和武運粳27最高，分別為0.675 7、0.582 8 kg/缽，但它們之間差異不顯著。甬優5550積累量最低，深兩優5867與黃華占之間的差異達到0.01水平顯著，但是與其余3個品種之間差異不顯著。鎘脅迫處理中武運粳27與黃華占、深兩優5867間氮存在差異，但沒有達到極顯著水平。不同品種鎘正常處理間P素干物質積累量以深兩優5867最高，以甬優5550最低，但差異不顯著，黃華占與除甬優5550之外的其余3個品種間差異達0.01顯著水平。此外，在不同品種加鎘處理間，甬優5550對P的積累量最高，深兩優5867最低，它們之間差異在0.01水平極顯著，黃華占、武運粳27、甬優538之間差異都沒達到0.01顯著水平。就K素含量而言，鎘正常處理以甬優5550以及鎘脅迫處理以深兩優5867積累K的能力最強，其余品種相互間差異均沒達到0.01顯著水平。

2.2 鎘脅迫對分蘗期水稻氮代謝關鍵酶活性的影響

2.2.1鎘脅迫對分蘗期水稻葉片NR活性的影響。NR是植物葉片內一種與氮代謝相關的至關重要的氧化還原酶，可催化硝酸離子還原成亞硝酸離子。

表1 Cd脅迫下不同基因型水稻分蘗期地上部植株氮、磷、鉀累積量 kg/缽

注：同列不同小寫字母表示P<0.05差異顯著性水平，不同大寫字母表示P<0.01差異極顯著水平。

由圖1可知，鎘脅迫影響分蘗期水稻葉片硝酸還原酶活性，其影響程度因品種而異，其中鎘脅迫明顯地促進黃華占和春深兩優5867活性的提高；對于武運粳27、甬優5550和甬優538則為抑制作用，除甬優538外其余2個品種各處理間差異均達0.01顯著水平。不同品種同一處理差異較大，鎘正常處理以深兩優5867和甬優5550的NR活性最高，它們之間差異不顯著，但是與其他3個品種差異達0.01顯著水平。鎘脅迫處理也表現出相似的規律，以深兩優5867和甬優5550的NR活性最高，并與其他3個品種之間存在0.05水平顯著差異。由此可知，鎘脅迫對分蘗期水稻NR活性的抑制作用只微弱地表現在某些NR活性較高的品種上，而對那些正常處理活性較低的品種甚至有促進作用。同一處理水稻分蘗期NR活性大小間的差異主要由基因決定。

2.2.2鎘脅迫對分蘗期水稻葉片GS活性的影響。GS是葉片內另一種對氮代謝十分重要的酶，可催化銨離子和谷氨酸來合成谷氨酰胺。在高等植物的研究中，GS也常被定義為植物氨同化所必須的酶。

由圖2可知，不同品種水稻分蘗期葉片對鎘的敏感度不同。其中，以鎘正常處理下GS活性較低的黃華占和甬優538對鎘脅迫最為敏感，鎘脅迫促進了它們GS活性的增加，且兩處理間差異達0.01顯著水平。但是，對鎘正常處理下GS活性較高的甬優5550和深兩優5867表現出抑制作用，其中甬優5550兩個處理間差異達0.01顯著水平。由此可知，鎘脅迫對不同品種水稻的影響因基因型的不同而變化。

2.2.3鎘脅迫對分蘗期水稻葉片GOGAT活性的影響。GOGAT是以谷氨酰胺的胺基為氨供體還原α-酮戊二酸為谷氨酸的酶，是植物體產生谷氨酸的主要途徑[12-13]。

由圖3可知，鎘脅迫促進了分蘗期水稻GOGAT活性的提高，其中以鎘正常處理下GOGAT活性最低的武運粳27的增加幅度最大，其余4個品種GOGAT活性也出現小幅度的增加。

2.3 考種與計產由表2可知，鎘正常處理無論是在株高、穗長、結實率、千粒重抑或平均每缽產量上均大于加鎘處理。這說明超標的鎘元素對水稻的生長發育不利，使其結實率下降，千粒重減少，導致水稻一定程度的減產。

3 結論

研究表明，就整體而言，鎘脅迫能夠提高分蘗期水稻體內N、P、K含量，分別以深兩優5867、甬優5550和武運粳27的提高幅度最高。同時，鎘脅迫在一定程度上促進NR、GS、GOGAT活性的提高。就NR活性而言，鎘脅迫明顯促進黃華占和甬優538NR活性的提高，對武運粳27、深兩優5867、甬優5550影響不明顯，但相互間差異都沒達到顯著水平。而對于GS活性，以鎘正常處理下GS活性較低的黃華占和武運粳27對鎘脅迫最為敏感。鎘脅迫促進它們GS活性的增加，且兩處理間差異達0.01顯著水平，但對鎘正常處理下GS活性較高的深兩優5867和甬優5550表現出抑制作用，相互間差異不明顯。鎘脅迫下的任一品種GS活性間差異并未達到顯著水平。鎘脅迫促進分蘗期水稻GOGAT活性的提高，其中以鎘正常處理下GOGAT活性最低的武運粳27的增加幅度最大。而鎘脅迫會對水稻的生長發育不利，使其結實率下降，千粒重減少，導致水稻不同程度的減產。這與前人的研究結果[14-17]一致。由此可知，鎘脅迫對氮素累積的促進作用與對3種酶活性的影響規律一致。這說明鎘脅迫是通過影響植株體內與氮代謝相關的酶如NR、GS、GOGAT活性來影響植株氮代謝的。因此，研究鎘脅迫條件下氮素代謝及其相關酶活性的變化，對探明氮素代謝酶在水稻Cd耐性上的作用以及水稻Cd耐性的生理原因具有重要意義。

表2 鎘脅迫對產量及其構成的影響

[1] SUN Y H，LI Z J，GUO B，et al.Arsenic mitigates cadmium toxicity in rice seedings[J].Environmental and Experimental Botany,2008,64(3):264-270.

[2] 王琴兒，曾英.鎘毒害對水稻生理生態效應的研究進展[J].北方水稻，2007(4):12-16.

[3] 魯如坤.我國磷礦磷肥中Cd的含量及其對生態環境影響的評價[J].土壤學報，1992,29(2)：139-150.

[4] 陳京都.水稻鎘脅迫響應差異機理和調控效應的研究[D].揚州：揚州大學，2013：1-10.

[5] AINA R，LABRA M，FUMAGALLI P，et al.Thiol-peptide level and proteomic changes in response to cadmium toxicity inOrtyzasativaL.roots[J].Environment Experiment Botany,2007,59(3):381-392.

[6] 趙其國，周炳中，楊浩.江蘇省環境質量與農業安全問題研究所[J].土壤，2002,1(1)：1-8.

[7] LIN A J，ZHANG X H，CHEN M，et al.Oxidative stress and DNA damages induced by cadmium accumulation[J].Journal of Environment Science,2007,19(5):596-602.

[8] WANG C X，MO Z，WANG H，et al.The transportation time-dependent distribution of heavy metals in paddy crops[J].Chemosphere,2003,50(6):717-723.

[9] DI TOPPILS，GABBRIELLI R.Response to cadmium in higher plants[J].Environ Exp Bot,1999,41:105-130.

[10] SCHUTZENDUBELA A,N IKOLOVA P,RUDOLF C,et al Cadmium and H2O2-induced oxidative stress in Populus canescents roots[J].Plant Physiol Bioehem,2002,40:577-584.

[11] 田艷芬，史錕.鎘對水稻等作物的毒害作用[J].土壤肥料，2005(5)：26-28.

[12] 滕祥勇.甜菜谷氨酸合成酶(GOGAT)酶學特性及氮素對其酶活性的調控[D].哈爾濱：東北農業大學，2012:1-13.

[13] 馬振勇，邵立紅，劉利峰，等.玉米葉片谷氨酸合成酶(GOGAT)的純化和特性研究[J].玉米科學，2009,17(5)：82-84.

[14] 王凱榮.鎘對不同基因型水稻生長毒害影響的比較研究[J].農村生態環境，1996，12(3)：18-23.

[15] 江行玉，趙可夫.植物重金屬傷害及其抗性機理[J].應用與環境生物學報，2001,7(1)：92-99.

[16] 張玉平，劉強，榮湘民，等.幾個早稻品種氮代謝關鍵酶活性的比較研究[J].湖南農業大學學報，2006,32(2)：1-5.

[17] ZHANG G P，FUKAMI M，SEKIMOTO H.Influence of cadmium on mineral concentrations and yield components in wheat genotypes differing in Cd tolerance at seeding stage[J].Field Crops Research,2002,77:93-98.

Effects of Cadmium Stress on Key Enzymes Involved in Nitrogen Metabolism and Nitrogen, Phosphorus and Potassium Accumulation of Different Varieties of Rice

HUANG Wei1,2,3,4, PENG Jian-wei1,2,3,4*,GONG Rong1,2,3,4et al

(1.College of Resources and Environment, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128; 2.Hunan Provincial Key Laboratory of Farmland Pollution Control and Agricultural Resources Use, Changsha, Hunan 410128; 3.Hunan Provincial Key Laboratory of Plant Nutrition in Common University, Changsha, Hunan 410128; 4.National Engineering Laboratory on Soil and Fertilizer Resources Efficient Utilization, Changsha, Hunan 410128)

[Objective] The research aimed to study the effects of nitrogen metabolism enzymes on Cd tolerance of rice and the physiological reasons of Cd tolerance of rice. [Method] The pot experiment was used to explore the differences of activities of key enzymes involved in N metabolism and N,P and K accumulation under Cd stress during the tilliering stage of different varieties of rice. [Result] Cadmium stress could increase N,P,K concentration of different varieties of rice in the tillering stage, while Shen-Liangyou 5867 and Yongyou 5550 and Wu-Yunjing 27 showed the highest amplification. Morever, cadmium stress could contribute to the increase of the activities of NR, GS and GOGAT.For the activity of NR, the cadmium stress significantly contributed to the increase of NR activity of Huang-Huazhan and Yongyou 538, but wasn’t significant for Wu-Yunjing 27,Shen-Liangyou 5867 and Yongyou 5550.However the difference among them wasn’t obvious.For the activity of GS, Cd stress promoted GS activity. Huang-Huazhan and Wu-Yunjing 27 with low activity in Cd normal level were the most sensitive. Meanwhile, the difference between two treatments was the most significant. On the other hand,the normal treatment of Cd restrained the GS activity of Shen-Liangyou 5867 and Yongyou 5550, and the difference wasn’t significant. And under cadmium stress, either difference reached significant in GS activity. Cd stress improved the activity of GOGAT,and Wu-Yunjing 27 showed the highest improvement which showed the lowest GOGAT activity under Cd normal level. [Conclusion]Cadmium stress had adverse effect on rice growth and development,wich made its lower seed setting rate, 1000 grain weight decreased, resulting in different reduction degrees of rice output.

Rice; Cadmium stress; Tillering stage; Nitrogen metabolism

“十二五”國家科技支撐計劃項目，“南方丘陵山地農區農業面源污染防控技術集成與示范”，2012BAD15B04；湖南省高校創新平臺開放基金項目，“水稻對生長關鍵期高溫逆境的氮代謝響應機理研究”，13K061；湖南省自然科學基金項目，“水稻對生長季極端高溫氮代謝的響應機理研究”，12JJ6016。

黃維(1989-)，男，湖南湘陰人，碩士研究生，研究方向：施肥原理與技術。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事植物營養生理與環境生態方面的研究。

2014-12-02

S 511

A

0517-6611(2015)02-019-04