5-氮雜-2′-脫氧胞苷誘導肝癌細胞株SLIT2基因去甲基化的實驗研究

李培坤 耿小平

5-氮雜-2′-脫氧胞苷誘導肝癌細胞株SLIT2基因去甲基化的實驗研究

李培坤 耿小平

目的 觀察肝細胞癌(HCC)細胞株SUN449、BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B及epG2中SLIT2基因在5-Aza-CdR作用后，其啟動子區甲基化狀態及表達的變化，探討HCC細胞株中SLIT2基因調控規律及甲基化調節抑制劑5-Aza-CdR對SLIT2基因轉錄的影響。方法對上述HCC細胞株體外培養，MSP法檢測HCC細胞株中SLIT2啟動子相關區域的甲基化狀況。應用10 mmol/L濃度的5-Aza-CdR處理體外培養的5種HCC細胞后，MSP法檢測用藥前后細胞中SLIT2基因的甲基化狀態，RT-PCR法檢測用藥前后細胞中SLIT2 mRNA的變化。結果SLIT2基因在各細胞株中啟動子區呈異常高甲基化狀態，mRNA低表達。經過5-Aza-CdR 處理后，SLIT2 基因啟動子區呈顯著去甲基化狀態，其mRNA表達增強。結論啟動子區異常甲基化是HCC細胞SLIT2基因失活的主要原因之一，去甲基化制劑5-Aza-CdR 能逆轉SLIT2 基因甲基化狀態, 從而調控SLIT2 基因表達。

5-氮雜-2'-脫氧胞苷；肝細胞癌；SLIT2基因；DNA甲基化

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC) 為起源于肝細胞的惡性腫瘤，其惡性度高，缺乏較有效的治療手段，術后復發和肝內轉移普遍，在惡性腫瘤中，HCC發病率位列第5，病死率位列第3[1]。近年來，表觀遺傳學改變與HCC發生、發展的關系逐步被揭開，目前認為抑癌相關基因啟動子DNA堿基異常甲基化修飾導致其表達失活在HCC發生發展過程中起重要作用，本研究小組前期在HCC組織標本和HCC細胞株中對多種基因進行了甲基化檢測，篩選出甲基化率較高的SLIT2等基因[2]，本文擬在前期研究基礎上，應用甲基化特異PCR技術(methylation-specific PCP，MSP)，探討去甲基化制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-CdR)對SUN449、BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B和HepG2 5種HCC細胞株中SLIT2基因異常高甲基化的逆轉作用，為HCC的去甲基化治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 所用HCC細胞株系香港中文大學惠贈并于我實驗中心留存，試劑5-Aza-CdR購自Sigma公司，DNA提取試劑盒購于Qiagen公司；提取全細胞RNA Trizol試劑為Invitrogen公司產品，DMEM細胞培養基購自Hyclone公司；DNA提取并甲基化修飾試劑盒為GEPIGENTEK公司產品；逆轉錄PCR試劑盒、Taq酶和dNTP購自TaKaRa公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HCC細胞培養 各細胞株在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37℃中5%CO2的條件下培養，培養至細胞處于對數生長期后，活細胞計數比例大于95%時用于實驗。在含10 mL/L胎牛血清的DMEM培養液中待饑餓培養24 h后，在細胞培養瓶中加入含有10 mmol/L 5-Aza-CdR的細胞培養液，培養后第1、3天換取同樣含藥濃度的培養液繼續培養，培養至第5天收集細胞用于實驗。設未加藥物培養液培養的細胞作為對照組。

1.2.2 MSP法檢測各細胞株中SLIT2啟動子甲基化狀態 各細胞株加入含5-Aza-CdR培養液作用5 d后，分別收集細胞，提取各細胞株基因組DNA，細胞基因組DNA提取及甲基化修飾：按照QIAmp DNA Mini and Blood Mini Kit 成品試劑盒步驟提取各細胞株基因組DNA，應用紫外線分光光度法檢測提取DNA濃度和純度，應用一步法DNA修飾試劑盒對所提取的DNA進行修飾，甲基化特異PCR擴增反應總體系25 μL，包括樣本DNA 1.0 μL, 10×PCR buffer 2.5 μL, 甲基化或非甲基化引物各0.5 μL, dNTP 2 μL, Taq酶0.2 μL, PCR-Water 18.3 μL。MSP反應條件：95℃預變性10 min; 95℃ 1 min，甲基化及非甲基化均 68℃退火1 min, 72℃ 1 min, 45個循環；72℃延伸10 min。以未加引物只加PCR-Water的體系作為空白對照，梯度為100 bp 的1 000 bp DNA Ladder作為分子量標記，據相關文獻提供序列合成引物：①SLIT2基因甲基化引物：上游序列：5′-TTG GGG CGC GGG TTT GGG TTT TTA CGC-3′，下游序列：5′-CGT AAA CGA CGC CGA CCC CAC TA-3′;②非甲基化引物： 上游序列：5′-TTG GGG TGT GGG TTT GGG TTT TTA TG-3′，下游序列：5′- CAT AAA CAA CAC CAA CCC CAC TA -3′ ，甲基化及非甲基化產物大小均為160 bp，2%瓊脂糖凝膠電泳，設定電壓100 V，電泳時間30 min，紫外凝膠成像系統下照相分析。每組實驗均重復3次。

1.2.3 RT- PCR法分析SLIT2 mRNA表達 用TRIzol 法提取各HCC細胞總RNA, 紫外分光光度測定判斷提取RNA濃度及純度，按濃度算取 2 μg 總RNA，以其為模板并與逆轉錄酶和Oliga(dT)引物反應逆轉錄合成cDNA，SLIT2引物序列：上游序列：5′-GGT GTC CTC TGT GAT GAA GAG-3′，下游序列：5′-GTG TTT AGG AGA CAC ACC TCG-3′，SLIT2產物片段387 bp。選擇GADPH為內參：其上游引物序列：5′-GAC CCC TTC ATG ACC TCA ACT ACA-3′，下游引物序列：5′-CTA AGC AGT TGG TGG TGC AGG A-3′，產物片段為100 bp，兩對引物同時加入 25 μL 體系中，聚合酶鏈反應反應條件： 95℃ 預變性5 min; 95℃ 變性90 s, 61℃ 復性30 s, 72℃延伸30 s, 共30循環; 72 ℃延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產物，核酸凝膠圖像分析儀攝影并分析RT-PCR產物。實驗重復3次。

2 結果

2.1 5-Aza-CdR對SLIT2甲基化狀態的影響 SLIT2基因在5種HCC細胞株中表現為異常高甲基化狀態，未擴增出非甲基化產物，對各HCC細胞株用10 mmol/L濃度的5-Aza-CdR作用5 d后，各HCC細胞株MSP產物同時擴增出甲基化和非甲基化產物，表現為甲基化和非甲基化狀態并存，而對照組未見擴增產物(圖1)。實驗得出，HCC細胞株中SLIT2基因啟動子呈完全甲基化狀態，去甲基化制劑5-Aza-CdR能使SLIT2基因異常高甲基化狀態得到一定程度的逆轉，使該基因啟動子表現為部分甲基化現象，有效降低該基因甲基化程度。

2.2 SLIT2基因 mRNA的表達 以5-Aza-CdR干預前，SUN449、BEL-7402、Hep3B 細胞株中SLIT2 mRNA微弱表達甚至不表達，以10 mmol/L 濃度的5-Aza-CdR干預各細胞后，3種細胞株RT-PCR結果均出現明顯產物條帶，表明此3種HCC細胞株中異常高甲基化狀態的SLIT2基因轉錄受到抑制，異常高甲基化狀態得到逆轉后重新獲得mRNA的表達能力；在HCC細胞株SMMC-7721和HepG2中，5-Aza-CdR干預前后均可見mRNA表達(圖2)。

3 討論

神經生長導向因子2(SLIT2)基因被認為是候選抑癌基因[3]，是SLIT-ROBO基因家族成員之一，該基因家族編碼的膜相關蛋白與ROBO相關基因表達的蛋白相互作用，發揮配體功能[4]，主要介導炎性趨化、細胞和凋亡、血管內皮的生成和移動[5]。SLIT2基因啟動子異常高甲基化已在多系統腫瘤中被發現。本課題組前期實驗證實SLIT2在HCC組織標本中甲基化率為78%[6]，在SUN449、BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B和HepG2細胞株中均出現完全甲基化，甲基化率為100%，推測SLIT2基因異常甲基化使基因表達沉默可能在HCC的發生及侵襲、轉移過程中起重要作用，提示SLIT2可能是HCC的靶基因。

DNA異常甲基化為表觀遺傳學變化[7]，其在原基因堿基排列順序不變的基礎上，通過加減甲基的方式改變基因結構，從而使改變后的基因表達發生變化，開啟或關閉基因的表達行為，這就使對某些腫瘤相關基因，如抑癌基因的調控，改變其遺傳特性作為治療腫瘤的手段成為可能。甲基化調節劑能上調或下調基因甲基化水平，5-AZA-CdR為核苷類甲基化調節劑，主要作用于細胞周期的S期[8]，其機制主要通過特異性抑制DNA甲基轉移酶活性阻斷其甲基化反應[9]，下調基因甲基化狀態而被研究用于抑制腫瘤的生長，其在間質性腫瘤中的基礎和臨床研究已初見成效，并逐漸被推廣至實性腫瘤的研究中，Liu 等[10]用5-AZA-CdR干預中國視網膜母細胞瘤細胞株HXO-RB44發現，藥物干預后HXO-RB44 抑癌相關基因RASSF1A甲基化率明顯降低，且能抑制細胞生長、誘導細胞凋亡。Ma等[11]同時檢測了肺癌癌旁組織及肺癌細胞株，發現Syk基因在肺癌細胞株異常高甲基化同時表達沉默，癌組織較癌旁組織Syk表達明顯降低，4 μmol/L的5-Aza-CdR使異常高甲基化狀態的Syk得到逆轉而重新表達。Mirza等[12]用5-AZA-CdR聯合PTX、ADR、5-FU對MDA、MB231 和MCF-7乳腺癌細胞株進行干預，發現聯合10 μmol/L的5-Aza-CdR能增強化療藥物的作用，藥物聯合使用較單用5-Aza-CdR更顯著降低 SLIT2基因的甲基化水平。

Liu等[13]研究發現5-Aza-CdR處理HCC細胞株Huh7后誘導甲硫氨酸腺苷轉移酶-1A基因mRNA轉錄及相應蛋白表達，同時通過下調Bcl-2、上調 Bax 和Caspase-3抑制細胞生長。黃鈾新等[14]用不同濃度的5-Aza-CdR作用HepG2細胞后，RT-PCR、Western blot分別檢測DLK1基因及蛋白的表達水平，用MTT、Transwell和流式細胞術檢測HepG2細胞的生長、侵襲性變化，發現處理后DLK1 mRNA及蛋白表達量均降低；HepG2細胞生長、增殖、侵襲能力得到抑制。在本實驗中，對5種HCC細胞株進行多種基因的去甲基化檢測，發現SLIT2基因在5種HCC細胞株中均出現甲基化產物條帶而無非甲基化產物條帶，提示SLIT2基因啟動子區域在五種HCC細胞株中為完全甲基化，甲基化狀態相同，證實SLIT2基因啟動子區域在五種HCC細胞株中均呈異常高甲基化現象，提示SLIT2基因異常甲基化在肝癌細胞株中為普遍現象，SLIT2基因異常甲基化預示腫瘤的發生，為肝癌發生的表觀遺傳學特征之一。用去甲基化制劑5-Aza-CdR處理各HCC細胞株后，SLIT2基因甲基化和非甲基化產物條帶同時出現，提示SLIT2基因異常甲基化得部分到逆轉。同時在轉錄水平應用RT-PCR方法檢測去甲基化處理后SLIT2基因再表達情況，RT-PCR顯示處理前SLIT2 mRNA不表達或低表達，而處理后其產物表達則明顯增加。SLIT2基因去甲基化伴隨著轉錄水平的上調，說明兩者存在著內在關聯，可以認為該基因在肝癌細胞株中異常高甲基化導致了基因表達沉默，甲基化水平得到逆轉后又部分恢復了轉錄表達水平，從而部分開放了基因功能。本實驗5-Aza-CdR通過甲基化調節作用誘導SUN449、 BEL-7402、Hep3B 3種細胞株中原本微弱表達甚至低表達的SLIT2 mRNA 重新表達，與文獻報道相符，但SMMC-7721和HepG2 細胞株中處理前后均出現明顯條帶，未得出5-Aza-CdR干預前后對轉錄的影響，原因可能是缺乏定量或半定量數據顯示表達變化，也可能有其他遺傳學及表觀遺傳學機制參與抑癌相關基因的調控，下一步研究擬運用定量及半定量的方法，設置藥物的濃度梯度干預判定去甲基化干預效果，另外尋找基因去甲基化修飾與其他表觀遺傳學變化之間的內在聯系，進一步探討HCC去甲基化干預的潛在臨床應用價值。

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(2014-10-11 收稿 2014-12-21 修回)

5-Aza-CdR induces demethylation of SLIT2 gene in human hepatoma cell lines

LiPeikun,GengXiaoping

DepartmentofGeneralSurgery,theSecondAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230601,China

Objective To investigate the effect of 5-Aza-CdR on methylation state and transcription of SLIT2 gene in hepatocellular carcinoma cell lines, and to discuss mechanism of SLIT2 gene silencing in 5 human hepatoma cell lines as well as the effect of demethylation agent on its expression.MethodsAll cell lines of SUN449, BEL-7402, SMMC-7721, Hep3B and HepG2 were cultured in vitro and treated with 10 mmol/L 5-Aza-CdR. The promoter methylation state of SLIT2 gene and the mRNA expression of SLIT2 gene in the 5 hepatoma cell lines before and after 5-Aza-CdR treatment were detected by methylation-specific PCP (MSP) and reverse transcription-PCR (RT-PCR), respectively.ResultsPromoter hypermethylation of SLIT2 gene was detected in all 5 hepatoma cell lines and SLIT2 gene was expressed at a low level before 5-Aza-CdR treatment. After treated with demethylation agent 5-Aza-CdR, the promoter region of SLIT2 gene exhibited demethylation state, and gene expression increased significantly at mRNA level.ConclusionPromoter hypermethylation is a main mechanism of SLIT2 gene silencing in 5 human hepatoma cell lines, and could be reversed by demethylation agent 5-Aza-CdR.

5-Aza-CdR; Hepatocellular carcinoma; SLIT2 gene; DNA methylation

安徽省科技攻關計劃面上項目 (編號：08010302191)

230601 合肥 安徽醫科大學第二附屬醫院普外科

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.02.002