寒痹康湯對膠原誘導性關節炎大鼠血清VEGF的影響＊

龐學豐 舒建龍 李玉玲 吳燕紅 唐麗萍 劉 歡 蒙宇華 馮玉青 雷宗尚龍朝陽 廖鍵僥 林 菊 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院（南寧 530011）

類風濕關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以侵犯外周關節為主的自身免疫病，晚期患者出現關節結構破壞、畸形以及功能喪失。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種在RA發病中起到重要作用的血管新生誘導劑。本實驗采用牛Ⅱ型膠原蛋白和弗氏不完全佐劑混合誘導CIA大鼠模型，觀察寒痹康湯對其血清VEGF水平的影響情況。

1 實驗用品及材料 60只清潔級Wistar雌性大鼠（體重100±10g）購于廣西中醫藥大學實驗動物中心；實驗用VEGF檢測試劑盒、弗氏不完全佐劑和牛Ⅱ型膠原蛋白分別購于南京建成生物工程研究所、美國Chondrex公司；對照藥甲氨蝶呤片為上海醫藥（集團）有限公司信誼制藥總廠產品；補腎抗風濕方藥（寒痹康湯）提取物由廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院新藥研發中心制備提供，將寒痹康湯（秦艽、黃芪、青風藤各15g，防風、熟附子、麻黃、當歸各10g，淫羊藿、狗脊各20g）經乙醇萃取，50℃溶解離心，取上清液得到含有活性部位的浸膏，實驗前用溶劑（2%乙醇＋98%生理鹽水）配制成2×10－7g／L的溶液。

2 實驗方法 2.1 分組與造模 60只清潔級Wistar雌性大鼠喂養7d后，隨機挑選10只作為正常對照組，剩下50只參照文獻［1］方法進行造模：在無菌條件下用冰醋酸充分溶解牛Ⅱ型膠原蛋白，再與等體積的弗氏不完全佐劑充分混合乳化制成CⅡ乳劑，放置4℃冰箱保存。實驗時于大鼠頸、背部進行多點皮內注射CⅡ乳劑造模，14d后再次注射CⅡ乳劑進行免疫（方法和劑量同前）。造模成功的標準是大鼠四肢足爪均嚴重腫脹、踝關節直徑增長幅度≥2mm（評分4分）。確定造模成功后，再隨機分為模型組、寒痹康湯高、中、低劑量組、甲氨蝶呤組，每組10只。

2.2 給 藥 正常對照組大鼠自由進食和飲水；模型組灌服生理鹽水（2mL／100g），1d1次；甲氨蝶呤組每周灌服甲氨蝶呤藥液（2.7mg·kg－1）1d1次；寒痹康湯高、中、低劑量組，分別給予31.25g／100g／d、15g／100g／d、7.5g／100g／d寒痹康湯提取物（1d分2次）進行灌胃。

2.3 關節腫脹評分 參照有關文獻［2］標準進行評分：無關節炎評0分，小趾關節輕度腫脹評1分，小趾關節和足跖腫脹評2分，踝關節以下的足爪腫脹評3分，包括踝關節在內全部關節腫脹評4分。觀察并記錄各組大鼠治療前、治療后1周、2周、4周的關節腫脹情況。

2.4 血清VEGF水平的檢測 給藥治療28d后，用水合氯醛麻醉各組大鼠，于腹主動脈處取血，分離血清后保存于－20℃冰箱，檢測時按試劑盒說明采用ELISA法測定VEGF的含量。

2.5 統計學分析 采用SPSS15.0統計軟件進行數據分析，所有數據以（）表示，不同組間用方差分析及t檢驗。

3 實驗結果 3.1 治療前后各組大鼠關節腫脹情況比較 治療2周后，各治療組大鼠關節腫脹指數均低于模型組，其中寒痹康湯高、中劑量組、甲氨蝶呤組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。治療4周后，各治療組大鼠關節腫脹指數與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），其中高劑量寒痹康湯作用優于甲氨蝶呤（P＜0.01），中劑量寒痹康湯作用與甲氨蝶呤相當（P＞0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠關節腫脹指數比較（）

表1 各組大鼠關節腫脹指數比較（）

注：與模型組比較，△P＜0.01，▲P＜0.05；與甲氨蝶呤組比較，◇P＜0.01，◆P＞0.05

組 別 n 給藥前 治療后1周 治療后2周 治療后4周正常組10 0 0 0 0模型組 10 3.86±0.24 3.86±0.17 3.78±0.18 3.62±0.13寒痹康湯高劑量組 10 3.91±0.16 3.74±0.25 2.72±0.47△ 1.64±0.32◇寒痹康湯中劑量組 10 3.88±0.18 3.79±0.19 3.13±0.36△ 2.18±0.52◆寒痹康湯低劑量組 10 3.92±0.16 3.84±0.17 3.59±0.13▲ 2.88±0.31甲氨蝶呤組 10 3.89±0.22 3.83±0.23 3.16±0.46△1.85±0.27

3.2 治療前后各組大鼠血清VEGF變化比較 各組VEGF水平與正常對照組比較均升高（P＜0.01）；治療4周后各給藥組血清VEGF水平與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），其中高劑量寒痹康湯作用優于甲氨蝶呤（P＜0.01）、中劑量寒痹康湯作用與甲氨蝶呤相當（P＞0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠血清VEGF變化情況比較（）

表2 各組大鼠血清VEGF變化情況比較（）

注：與正常對照組比較，△P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.01；與甲氨蝶呤組比較，◇P＜0.01，◆P＞0.05

組別 n VEGF濃度（pg／mL）正常組10 32.49±3.46模型組 10 70.75±5.19△寒痹康湯高劑量組 10 42.65±3.37△▲◇寒痹康湯中劑量組 10 46.84±2.71△▲◆寒痹康湯低劑量組 10 63.84±6.32△▲甲氨蝶呤組 10 54.25±3.75△▲

4 討 論 類風濕關節炎的病理改變是炎性細胞浸潤、滑膜增生、血管翳形成、侵蝕軟骨及骨組織，血管翳是造成關節破壞、畸形、功能障礙的病理基礎，血管新生是RA慢性增生性滑膜炎和血管翳形成中的一個重要環節，血管內皮生長因子是血管生成中最重要的因子之一，在RA的發病中其可以通過受體特異性作用于血管內皮細胞，促進血管內皮細胞的有絲分裂和新生血管的形成；VEGF又能增強血管的通透性，促使血管內物質的滲出，血管內營養物質的滲出為滑膜增生提供營養；血管內炎性細胞和炎性介質的滲出促進了滑膜炎癥的持續存在［1］。有研究表明RA患者血清中VEGF水平較骨關節炎及健康對照組明顯升高，并且其升高水平與病情嚴重程度及類風濕因子、炎性指標相關，可以做為判斷疾病活動的指標［3－4］。有實驗證實向關節腔內注射VEGF抗體或其受體拮抗劑可有效抑制滑膜血管翳的形成，減輕RA的發病癥狀［5］，因此抑制VEGF的表達已經成為治療RA的一個靶點和研究方向。

RA屬中醫“痹病”范疇，《素問·痹論》云：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也。”《素問·評熱病論》曰：“邪之所湊，其氣必虛。”痹病的發生與正氣虧虛及感受風寒濕之邪有關，其治療當以扶正祛邪為原則。寒痹康湯是龐學豐教授治療寒濕型活動期RA的經驗方，由補腎及抗風濕藥物組成，具有補益肝腎、益氣血、祛風除濕、蠲痹止痛的作用。我們在臨床上應用寒痹康湯治療寒濕型RA患者，發現其能改善患者關節疼痛［6］、腫脹、壓痛、晨僵等癥狀，能使升高的血沉、CRP、RF、免疫球蛋白等下降或恢復正常，無明顯毒副作用。動物實驗表明寒痹康湯能降低 CIA大鼠 TNF－α、IL-6、IL-1β、NFκ-B的水平［7－9］，而這些細胞因子在RA的發病、發展過程當中，可以誘導VEGF的高表達，從而起到非常重要的作用。

本實驗結果發現經寒痹康湯治療后CIA大鼠血清VEGF水平和關節腫脹指數均相應降低，關節炎癥狀逐漸減輕，表明寒痹康湯能減輕CIA大鼠關節腫脹指數，降低VEGF水平，其能通過抑制VEGF的產生，抑制血管新生以及血管翳的生成，從而抑制關節滑膜增殖，減輕關節滑膜的炎癥，延緩關節骨質破壞，是其治療RA的作用機理之一。

［1］鄧安梅，仲人前，陳孫孝，等.關節炎中B7：CD28／CTLA-4共刺激途徑的實驗研究［J.中國免疫學雜志，200516（8）：412-414.

［2］Shibuya M.Differential roles of vascular endothelial growth factor receptor-1and receptor-2in angiogenesis［J］.J Biochem MolBiol，2006，39（5）：469-478.

［3］Clavel G，Bessis N，Lemeiter D，et al Angiogenes is markers（VEGF，soluble receptor of VEGF and ang iopoietin-1）in very early arthritis and their association with inflammation and joint destruction［J］.Clinical Immunology，2007，124（2）：158-164.

［4］樊有龍，傅穎媛.類風濕關節炎患者AECA、VEGF、IL-17的檢測及臨床相關性研究［J］.中國實驗診斷學，2010，14（6）：907-910.

［5］Grosios K，Wood J，Esser R，et al.Angiogenesis inhibition by the novel VEGF receptor tyrosine kinase inhibitor，PTK787ZK222584causes significant anti-arthritic effects in models of rheumatoid arthritis［J］.Inflamm Res，2014，53（4）：133.

［6］龐學豐，吳燕紅，蒙宇華.補益肝腎、祛濕蠲痹法治療寒濕型類風濕關節炎的臨床研究［J］.中國中醫骨傷科雜志，2006，14（1）：40-42.

［7］龐學豐，張 紅，唐麗萍，等.寒痹康湯對實驗性關節炎大鼠血清 TNF-α的影響［J］.中醫正骨，2008，20（12）：1-2.

［8］龐學豐，高立珍，吳燕紅，等.寒痹康湯對實驗性關節炎大鼠血清IL-6NO 的影響［J］.遼寧中醫雜志，2009，36（3）：481-482.

［9］龐學豐，任志宏，程世和，等.寒痹康湯對實驗性關節炎大鼠血清IL-1β及IL-4的影響［J］.陜西中醫，2009，30（7）：919-920.