PCSK9及IDOL在姜黃素促進HepG2細胞攝取LDL-C中的作用

歐 露，張彩平，劉 英，喬新惠，麻燕妮，歐 淳，胡小波，田 英，龍石銀

（1．南華大學生物化學與分子生物學教研室，湖南衡陽 421001；2．常德市職業技術學院醫學系，湖南常德 415000）

PCSK9及IDOL在姜黃素促進HepG2細胞攝取LDL-C中的作用

歐 露1，張彩平1，劉 英2，喬新惠1，麻燕妮1，歐 淳1，胡小波1，田 英1，龍石銀1

（1．南華大學生物化學與分子生物學教研室，湖南衡陽 421001；2．常德市職業技術學院醫學系，湖南常德 415000）

中國圖書分類號：R282．71；R329．24；R344．81；R972．6；R977.3；R977.6

摘要：目的 從分子水平探討姜黃素的降脂機制，為姜黃素作為降脂藥物的臨床開發提供科學依據。方法 本研究運用油紅O染色、酶法測定細胞內膽固醇含量，熒光染色檢測細胞膽固醇攝取，RT-Q-PCR及Western blot檢測姜黃素對HepG2細胞內膽固醇代謝相關因子在RNA和蛋白水平的表達。結果 姜黃素組的HepG2細胞內紅色脂滴明顯增多，且TC及FC含量增高。DiI標記LDL，姜黃素組HepG2細胞橙紅色熒光高于對照組。姜黃素能升高SREBP2和LDLR的mRNA和蛋白水平的表達；降低PCSK9蛋白成熟體及IDOL蛋白表達。結論 姜黃素可能通過下調PCSK9及IDOL的表達，進而減少LDLR降解，促進HepG2細胞攝取LDL-C。

關鍵詞：姜黃素；低密度脂蛋白受體；前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶9型；誘導低密度脂蛋白受體降解蛋白；固醇調節元件結合蛋白2；3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶

網絡出版時間：2015－8－10 14：37 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．021．html

血漿LDL-C水平增高是冠心病（coronary heart disease，CHD）最重要的危險因素，降低LDL-C水平是防治心血管疾病的首選策略［1］。血漿中絕大部分LDL-C主要經LDLR途徑代謝，LDLR數量、結構及功能異常等引起的高膽固醇血癥增加了AS-CVD患病風險［2］。LDLR的表達同時受到轉錄水平及翻譯后水平兩方面的共同調節，轉錄水平主要受固醇調節元件結合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2，SREBP2）的調節，誘導低密度脂蛋白受體降解蛋白（inducible degrader of low-densi-tylipoprotein receptor，IDOL）及前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶9型（proprotein convertase subtilisin／kexin type 9，PCSK9）則對LDLR進行翻譯后水平的調節。IDOL具有E3泛素連接酶的作用，通過介導LDLR泛素化經溶酶體途徑降解［3］，影響細胞表面LDLR的分布。他汀類藥物作為3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶的競爭性抑制劑［4］，可通過升高LDLR表達，降低血漿LDL-C水平，但同時卻升高了具有降低LDLR功能的PCSK9的表達，導致他汀類降脂作用受限［5］。為此，尋求具有降低IDOL及PCSK9表達，升高細胞表面LDLR水平的聯合用降脂新藥，仍是當前ASCVD防治的研究焦點。

姜黃素（curcumin）屬二酮類化合物，是從姜科、天南星科植物的根莖中提取的植物多酚［6］。研究表明姜黃素可明顯升高HepG2細胞LDLR的mRNA及蛋白水平，通過激活SREBP2并使得其靶基因LDLR表達水平增高［7］，起到降脂的作用。然而，Tai等［8］則認為是通過肝細胞核因子1α（hepa-tocyte nuclear factor 1α，HNF-1α）抑制轉錄水平PCSK9的表達，降低LDLR從溶酶體途徑降解，進而使HepG2細胞表面LDLR水平升高。因此，為進一步研究姜黃素的降脂機制，本實驗以HepG2為對象，探討姜黃素對LDLR的轉錄及翻譯后水平調節，為姜黃素作為降脂藥物的臨床開發提供科學依據。

1　材料

HepG2細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫；DMEM培養基和無支原體胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司；姜黃素和25-羥膽固醇（25-HC）購自美國Sigma公司；人源性LDL購自廣州弈源公司；人源性LPDS購自美國Biomedical Technol-ogies Inc．公司；油紅O和DMSO購自美國Amresco公司；組織總膽固醇／游離膽固醇酶法測定試劑盒（E1015／E1016）購自北京普利萊基因技術公司；總RNA提取試劑盒（TRIzo1 Reagent）購自康為世紀生物科技有限公司；DiI-LDL購自Invitrogen公司；兔抗人的LDLR、IDOL和PCSK9抗體購自Abcam公司，山羊抗人的SREBP2抗體購自R＆D公司，辣根過氧化物酶（horseradishperioxidase，HRP）標記的二抗：山羊抗兔和兔抗山羊均購自上海優維寧生物科技公司。其余均為進口或國產分析純試劑。

2　方法

2．1實驗分組 油紅O染色及膽固醇含量酶法測定分組：①Basal，②Control（25 mg·L－1LDL），③

curcumin（25 mg·L－1LDL＋25 μmol·L－1curcu-min），④Vehicle（25 mg·L－1LDL＋體積分數為0.000 625的DMSO）。

DiI-LDL、RT-Q-PCR及Western blot實驗分組：①Basal，②Control（25 mg·L－1LDL），③LPDS（體積分數為0．1的LPDS），④25-HC（10 mg·L－125-HC），⑤curcumin（25 mg·L－1LDL＋25 μmol· L－1curcumin）。

HepG2細胞接種于用含有體積分數為0．1的FBS和體積分數為0．01的青－鏈霉素的高糖DMEM培養液，在37℃條件下培養24 h后，再按上述分組藥物孵育24 h。

2．2油紅O染色觀察胞內脂質蓄積 細胞培養至對數生長期，每孔105個細胞接種至預先放置好無菌蓋玻片的6孔板內，培養24 h，藥物孵育24 h后，質量濃度為40 g·L－1的多聚甲醛固定30 min，油紅O染色7 min，蘇木精染色4 s，甘油封片，倒置顯微鏡拍照觀察，HepG2細胞中脂滴呈橘紅色，核呈藍色。

2．3酶法檢測細胞內膽固醇 細胞培養至對數生長期，每孔105個細胞接種細胞至6孔板培養24 h，再藥物孵育24 h，PBS洗3次，吸干余液，加入200 μL裂解液，冰上裂解10 min，收集裂解液，6 000 r· min－1離心5 min，取上清液，按照總膽固醇含量酶法測定試劑盒（E1015／E1016）的說明書操作，37℃條件下水浴20 min后，酶標儀分別測定總膽固醇和游離膽固醇的含量。BCA測各組細胞內總蛋白含量用于標化各樣本的膽固醇值，標化后膽固醇的濃度單位為：總膽固醇（游離膽固醇）／蛋白＝μmol·g－1。

2．4DiI-LDL攝取檢測 對數期生長HepG2細胞以每孔105個細胞接種6孔板內，貼壁生長24 h后，藥物孵育24 h。除Basal組外，其余各組更換培養液為體積分數為0.02的LPDS＋DMEM，加DiI-LDL 10 mg·L－1，避光37℃孵育4 h，含質量濃度為4 g ·L－1的BSA的PBS搖床搖洗2×5 min，PBS洗3次，質量濃度為40 g·L－1的多聚甲醛的PBS固定10 min，PBS洗3次，Hoechst 33342染色20 min，PBS 洗3次，加抗熒光淬滅液，熒光顯微鏡觀察，細胞膜呈橙紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。

2．5RT-Q-PCR測mRNA水平 對數期生長HepG2細胞以每孔106個細胞接種至50 mL培養瓶，培養24 h，藥物孵育24 h后，根據TRIzo1 Rea-gent說明書提取總RNA，紫外分光光度儀測定OD260／OD280比值介于1.9－2.1。瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性，28s rRNA、18S rRNA條帶清晰可見，RNA未被降解，提取的總RNA可用于后續實驗。根據逆轉錄試劑盒說明書操作，取2 μg總RNA逆轉錄合成cDNA，反應條件為：42℃、30 min，85℃、10 min；再取2 μg逆轉錄產物進行real time-PCR，反應體系為20 μL，引物由上海諾倫生物醫藥技術有限公司設計與合成（Tab 1）。PCR反應條件：50℃、2 min，95℃、3 min，然后95℃、12 s，62℃、40 s，40個循環。用ΔΔCT來計算基因的表達水平，計算公式如下：ΔCT＝目的基因CT值－β-ac-tin基因CT值；ΔΔCT＝實驗組ΔCT－對照組ΔCT；實驗組／對照組基因表達水平的倍數＝2－ΔΔCT。

2．6Western blot檢測蛋白表達水平 細胞接種培養24 h，藥物孵育24 h后，冰上裂解30 min，收集細胞裂解液4℃條件下，13 000 r·min－1離心15 min。小心吸取上清，每組預留5 μL裂解液用

于BCA蛋白定量。裂解上清：SDS-loading buffer＝4∶1混勻，100℃條件下煮沸5 min，于－20℃保存。電泳條件先恒壓80 V，30 min，后轉換為120 V，50 min；電泳完畢后切膠，0.22 μm PVDF膜甲醛活化5 min，恒流300 mA，3 h濕轉轉膜；質量濃度為50 g ·L－1的脫脂牛奶封閉2 h；TBST稀釋一抗（SREBP2稀釋1∶500；β-actin、LDLR、PCSK9和I-DOL稀釋比例均為1∶1 000），4℃搖床過夜，TBST洗脫一抗3×5 min；孵育二抗（1∶5 000），室溫溫和搖晃45 min，TBST洗脫二抗4×10 min；Tanon ECL高敏成像系統對結果進行檢測。各組細胞目的蛋白與內參β-actin的光密度比值，分別代表各目的蛋白表達水平。

Tab 1 Primer sequence

2．7統計學分析 數據均采用SPSS 13．0軟件進行統計學分析，數值以±s表示，兩組間的比較用單因素方差分析。

3　結果

3．1油紅O染色觀察姜黃素對HepG2細胞內脂質蓄積的影響 為研究姜黃素處理24 h后對HepG2細胞荷脂情況的影響，油紅O染色結果顯示：Control組中細胞內脂滴較Basal組增多；與Control相比，Vehi-cle組細胞內紅染脂滴無明顯變化，經curcumin處理的細胞內紅染脂滴明顯增加，表明curcumin促進HepG2細胞脂滴蓄積增多（Fig 1）。

Fig 1 Curcumin accelerates LDL uptake stained by Oil-red O（×40）

3．2酶法測定HepG2細胞內膽固醇含量變化 為研究姜黃素處理后細胞內膽固醇含量的變化，通過膽固醇酶法測定結果顯示：與Basal組相比，Control細胞內TC、FC水平增高，提示細胞荷脂成功；與Control相比，Vehicle組細胞內TC、FC水平有增高的趨勢，但差異無統計學意義，提示溶媒對細胞攝取膽固醇無明顯影響；curcumin組細胞內TC、FC水平明顯增高（P＜0.01），提示curcumin促使HepG2細胞攝取膽固醇使得胞內TC、FC含量明顯增高（Fig 2）。

Fig 2 Effect of curcumin on total cholesterol and free cholesterol in HepG2

3．3熒光染色檢測HepG2細胞膽固醇攝取的影響為研究HepG2細胞是否通過促進LDL攝取使膽固醇含量增高，DiI-LDL攝取實驗結果顯示：與Con-trol組比較，LPDS組HepG2細胞橙紅色熒光明顯增高，而25-HC組紅色熒光則明顯降低；curcumin組HepG2細胞橙紅色熒光高于Control組，表明curcu-min促進HepG2細胞LDL攝取（Fig 3）。

3．4姜黃素對HepG2細胞LDLR及SREBP2表達的影響 與Control相比，LPDS組和curcumin組LDLR和SREBP2的mRNA及蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；25-HC組LDLR和SREBP2的mR-NA及蛋白的表達減少（P＜0.05）；curcumin組的LDLR和SREBP2的mRNA水平明顯升高（P＜0.05）。結果提示，curcumin可能通過激活SREBP2促進LDLR表達增高（Fig 4）。

3．5姜黃素對HepG2細胞PCSK9及IDOL蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，與Control組相比，LPDS組中PCSK9蛋白明顯升高（P＜0.05），而誘導低密度脂蛋白受體降解蛋白（inducible de-grader of low-densitylipoprotein receptor，IDOL）蛋白

表達無差異；25-HC組中PCSK9蛋白水平明顯降低（P＜0.05），IDOL蛋白表達水平升高（P＜0.05）；curcumin組中PCSK9和IDOL蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。結果提示：curcumin可能通過降低了PCSK9及IDOL蛋白表達，減少了LDLR的降解，促進血漿LDL-C的清除（Fig 5）。

Fig 3 DiI-LDL uptake by HepG2 cells treated with curcumin for 24 hours（×20）

4　討論

Fig 4 Expression of LDLR and SREBP2 mRNA and protein｜treated with curcumin in HepG2 cells

美國心臟協會指出降低心血管事件主要歸因于LDL-C的下降，他汀類藥物通過競爭性抑制膽固醇合成限速酶的活性成為臨床降LDL-C的首選藥物，中等強度劑量他汀可降低血漿LDL-C 30%－40%的水平，不僅降低心血管事件，而且還降低了總死亡率，奠定了他汀在防控ASCVD事件中的核心地位［9－10］。然而他汀類還通過激活SREBP2使具有誘導LDLR經溶酶體降解的PCSK9表達增高［11］，加倍他汀用藥劑量僅進一步降低LDL-C的6%，且不良反應增加，致使他汀大劑量單用降脂作用受限。盡管AMG145（PCSK9單克隆抗體）已順利通過臨床Ⅲ期實驗階段［12］，具有明顯降低血漿LDL-C水平，減少ASCVD風險的療效，然而因其免疫原性及臨床使用方式有限均使AMG145作為生物制劑降脂

藥物開發存在一定的局限性。

Fig 5 Levels of PCSK9 and IDOL protein expression in HepG2 cells treated with curcumin for 24 hours

本實驗采用curcumin作用于體外培養HepG2細胞24 h，油紅O染色及膽固醇酶法測定結果表明，curcumin使HepG2細胞膽固醇蓄積增多；并通過DiI-LDL攝取實驗進一步表明curcumin促進HepG2細胞膽固醇攝取；LPDS是通過激活SREBP2促進LDLR mRNA及蛋白表達增高，作為陽性對照組；而25-HC是通過阻斷SREBP2的激活，使LDLR mRNA及蛋白表達降低，作為陽性對照組，curcumin處理組SREBP2及LDLR mRNA及蛋白表達增高，因LDLR是SREBP2下游靶基因，結果提示curcu-min可能通過激活SREBP2轉錄水平調節LDLR的表達增高，這一結果與Dou等［13］報道的一致。

LDLR途徑擔負著絕大部分血漿LDL-C的清除，LDLR的功能或表達異常產生高膽固醇血癥，增加了ASCVD患病風險［14］。LDLR除了受SREBP2轉錄水平調節之外，還受PCSK9及IDOL翻譯后水平的調節，影響著血漿LDL-C的代謝。通過GWAS （genome-wide association studies，GWAS）結果表明，墨西哥人群中IDOL的rs9370867因N342S與高膽固醇血脂高度正相關，而荷蘭人群中IDOL的R266X突變體引起明顯降低血脂的效應［15］，提示IDOL多態性或突變影響人類血漿LDL-C的清除。本實驗結果顯示，curcumin作用后，PCSK9及IDOL蛋白表達降低，表明curcumin可能通過翻譯后水平抑制LDLR經溶酶體途徑降解。curcumin還可通過抑制HNF-1α的活性降低PCSK9蛋白表達，減少LDLR溶酶體降解，促進HepG2細胞膽固醇攝取［11］。但還需進一步實驗證明，curcumin是否通過過多靶點抑制HNF-1α的轉錄活性，阻滯IDOL泛素化溶酶體降解LDLR，使LDLR蛋白表達增高，這將是本文后續研究闡述的重要目標。

（致謝：本文實驗主要在生物技術系的分子生物實驗室、蛋白化學實驗室、細胞培養室、技能實驗室及生物信息室等實驗室完成，謝謝本校省部級重點心血管病研究所、腫瘤研究所、病原微生物研究所對本實驗無償提供流式細胞儀、激光共聚焦顯微鏡等必要設備服務。）

參考文獻：

［1］ Bhattacharya B S，Sweby P K，Minihane A M，et al．A mathe-matical model of the sterol regulatory element binding protein 2 cholesterol biosynthesis pathway［J］．J Theor Biol，2014，349：150－62．

［2］ 張 銳，張紹芬．低密度脂蛋白受體及其調節機制研究進展［J］．國外醫學（老年醫學分冊），2009，01：29－33．

［2］ Zhang R，Zhang S F．The progress of LDL receptor and its regula-ting mechanisms［J］．Fore Med Sci（Geriatrics），2009，01：29－33．

［3］ Zelcer N，Hong C，Boyadjian R，et al．LXR regulates cholesterol uptake through Idol-dependent ubiquitination of the LDL receptor ［J］．Science，2009，325（5936）：100－4．

［4］ Watanabe Y，Suzuki S，Nishimura H，et al．Statins and myotoxic effects associated with anti-3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase autoantibodies：an observational study in Japan［J］．Medicine，2015，94（4）：e416．

［5］ Nakagami H，Koriyama H，Morishita R．Therapeutic vaccines for hypertension and dyslipidemia［J］．Int Heart J，2014，55（2）：96 －100．

［6］ 周中運，范春雷，竇曉兵，等．姜黃素對人正常肝細胞角蛋白1和內質網蛋白19表達的影響［J］．中國藥理學通報，2013，29（5）：700－3．

［6］ Zhou Z Y，Fan C L，Dou X B，et al．Effects of curcumin on ex-pression of cytokeratin 1 and endoplasmic reticulum protein 19 in human normal hepatocytes［J］．Chin Pharmacol Bull，2013，29 （5）：700－3．

［7］ Miao J，Haas J T，Manthena P，et al．Hepatic insulin receptor de-

ficiency impairs the SREBP-2 response to feeding and statins［J］．J Lipid Res，2014，55（4）：659－67．

［8］ Tai M H，Chen P K，Chen P Y，et al．Curcumin enhances cell-surface LDLR level and promotes LDL uptake through downregula-tion of PCSK9 gene expression in HepG2 cells［J］．Mol Nutr Food Res，2014，58（11）：2133－45．

［9］ Kohno T．Report of the american heart association（AHA）scien-tific sessions 2014［J］．Chicago Circ J，2015，79（1）：34－40．

［10］胡大一．降低密度脂蛋白是硬道理［J］．中華心血管病雜志，2015，43（1）：3－4．

［10］Hu D Y．Lower HDL is the last word［J］．Chin J Cardiol，2015，43（1）：3－4．

［11］Dubuc G，Chamberland A，Wassef H，et al．Statins upregulate PCSK9，the gene encoding the proprotein convertase neural apop-tosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterol-emia［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24（8）：1454－9．

［12］Desai N R，Giugliano R P，Zhou J，et al．AMG 145，a mono-clonal antibody against PCSK9，facilitates achievement of national cholesterol education program-adult treatment panel III low-density lipoprotein cholesterol goals among high-risk patients：an analysis from the LAPLACE-TIMI 57 trial（LDL-C assessment with PCSK9 monoclonal antibody inhibition combined with statin thErapy-thrombolysis in myocardial infarction 57）［J］．J Am Coll Cardiol，2014，63（5）：430－3．

［13］Dou X，Fan C，Wo L，et al．Curcumin up-regulates LDL receptor expression via the sterol regulatory element pathway in HepG2 cells ［J］．Planta Med，2008，74（11）：1374－9．

［14］Wilson D J，Gahan M，Haddad L，et al．A World Wide Web site for low-density lipoprotein receptor gene mutations in familial hy-percholesterolemia：sequence-based，tabular，and direct submis-sion data handling［J］．Am J Cardiol，1998，81（12）：1509－11．

［15］Santos P C，Morgan A C，Jannes C E，et al．The MYLIP p．N342S polymorphism is associated with response to lipid-lowering therapy in Brazilian patients with familial hypercholesterolemia ［J］．Pharmacogenet Genomics，2014，24（11）：548－55．

Role of PCSK9 and IDOL in curcumin accelerating LDL-C uptake in HepG2 cells

OU Lu1，ZHANG Cai-ping1，LIU Ying2，QIAO Xin-hui1，MA Yan-ni1，OU Chun1，HU Xiao-bo1，TIAN Yin1，LONG Shi-yin1
（1．Dept of Biotechnology，University of South China，Hengyang Hunan 421001，China；2．Dept of Medicine，Changde Vocational Technical College，Changde Hunan 415000，China）

Abstract：Aim To explore the lipid-lowering mecha-nisms of curcumin from the molecular levels and pro-vide scientific basis for clinical development of lipid-lowering drugs．Methods Using oil red O staining and enzymic to determinate the levels of cholesterol in HepG2 cells．Moreover，uptaking of DiI-LDL was also measured．The expressions of mRNA and protein were detected by RT-Q-PCR and Western blot．Results

The red lipid droplets and the levels of TC and FC sig-nificantly increased in HepG2 cells after treated with curcumin．The orange red fluorescence was higher than that of control．Curcumin could promote the expression levels of mRNA and protein of SREBP2 and LDLR，what′s more，curcumin could reduce the expression of the mature PCSK9 level and IDOL protein．Conclu-sion Curcumin accelerates LDL-C uptake probably via downregulating the expression of PCSK9 and IDOL in HepG2 cells．

Key words：curcumin；low density lipoprotein choles-terol receptor；proprotein convertase subtilisin／kexin type 9；inducible degrader of low-densitylipoprotein re-ceptor；sterol regulatory element binding protein 2；ac-tivation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A re-ductase

作者簡介：歐 露（1989－），女，碩士生，研究方向：脂蛋白與動脈粥樣硬化，E-mail：2985800843＠qq．com；龍石銀（1973－），女，博士，教授，研究方向：脂蛋白與動脈粥樣硬化，通訊作者，E-mail：longshiyin＠126．com

基金項目：湖南省科技廳項目（No 2015SK2038）；湖南省衛生計生委項目（No B2015-49）；湖南省高層次衛生人才“225”工程項目基金；湖南省自然科學基金（No 2014JJ3104）；南華大學研究生科研創新項目（No 2013XCX20）；南華大學“十二五”科技創新團隊基金，南華大學留學回國人員啟動基金（No 2013XQD52）；湖南省大學生研究性學習和創新性實驗計劃項目資助（No 2015-230）

收稿日期：2015－05－11，修回日期：2015－06－15

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1286－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．021