PPARβ在虎杖苷抗高糖高胰島素誘導心肌肥大中的作用

黃 波，江 芬，薛 萊，吳 陽，杜為民，邱紅梅，蔣青松

（1．重慶醫科大學藥理教研室，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016；2．湖北省蘄春縣人口和計劃生育服務中心，湖北蘄春 436300）

PPARβ在虎杖苷抗高糖高胰島素誘導心肌肥大中的作用

黃 波1，江 芬2，薛 萊1，吳 陽1，杜為民1，邱紅梅1，蔣青松1

（1．重慶醫科大學藥理教研室，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016；2．湖北省蘄春縣人口和計劃生育服務中心，湖北蘄春 436300）

中國圖書分類號：R-332；R284．1；R322．11；R329．24

摘要：目的 觀察虎杖苷（polydatin，PD）對高糖高胰島素［（high glucose and insulin，HGI）葡萄糖25．5 mmol·L－1＋胰島素0.1 μmol·L－1］誘導心肌肥大的影響，并探討過氧化物酶體增殖物激活受體β（peroxisome proliferator activated receptors-β，PPARβ）、核轉錄因子κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）及一氧化氮（nitric oxide，NO）相關信號通路在其中可能存在的作用。方法 體外培養乳鼠心肌細胞，以細胞表面積、蛋白含量和心房利鈉因子（atrial natriuretic factor，ANF）mRNA表達作為心肌細胞肥大反應指標；利用qRT-PCR、Western blot法分別檢測PPARβ、NF-κB p65及誘導型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）mR-NA及蛋白表達，硝酸還原酶法和分光光度法分別檢測NO含量和NOS活性。結果 HGI作用下，細胞表面積增大、總蛋白含量增加、ANF mRNA表達升高（P＜0.01），出現明顯的心肌肥大；同時，PPARβ表達降低，而NF-κB p65、iNOS表達明顯升高；總NOS活性及NO含量亦增加（P＜0.01）。PD （0.1、1、10 μmol·L－1）明顯抑制HGI誘導的心肌細胞肥大（P＜0.01）；并逆轉HGI對PPARβ及NF-κB p65、iNOS表達和總NOS活性、NO含量的影響。PPARβ選擇性阻斷劑GSK0660可阻斷PD對心肌肥大的保護，取消其上述作用（P ＜0.05）。結論 PD對HGI誘導的心肌肥大具有保護作用，其機制可能與其上調PPARβ表達，抑制NF-κB-iNOS-NO信號通路激活有關。

關鍵詞：虎杖苷；心肌肥大；高糖高胰島素；PPARβ；NF-κB；一氧化氮；糖尿病

網絡出版時間：2015－8－10 14：37 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．017．html

近年來，糖尿病發病率逐年增高。流行病學調查顯示，70%以上的糖尿病病人死于心血管系統并發癥。糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病常見的并發癥，心肌肥厚是其關鍵的結構改變。現有研究已證實，高糖血癥和高胰島素血癥均可作為獨立因素參與心肌肥厚的形成。目前對DCM的治療主要集中在控制和調節血糖、血脂、血壓等危險因素方面。虎杖苷（polydatin，PD）是從傳統中藥虎杖中提取的有效成分，有較高生物學活性。藥理學研究和臨床實踐已證明，PD具有調節糖脂代謝、抗炎抗氧化、影響離子通道等作用，對心力衰竭、缺血／再灌注損傷、組織損傷等均有保護作用［1］。但對于PD在糖尿病心肌肥厚中的作用，目前國內外未見報道。

過氧化物酶體增殖物激活受體β（peroxisome proliferator activated receptors-β，PPARβ）參與細胞的脂質代謝和葡萄糖利用，維持機體能量平衡，在代謝性疾病中具有重要的調節作用［2］。我們利用高糖高胰島素（high glucose and insulin，HGI）模擬糖尿病時高糖血癥和高胰島素血癥環境對心肌細胞影響的研究中發現，PPARβ相關信號通路在糖尿病心肌肥大中具有重要作用［3］。Alvarez-Guardia等［4］報道，PPARβ激活可下調核轉錄因子κB（nuclear tran-scription factor-κB，NF-κB）的表達，從而抑制心肌炎癥和肥大［4］。誘導型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）與一氧化氮（nitric oxide，NO）作為重要的炎癥介質，是NF-κB重要的下游因子。本實驗室PPARs配體的篩選研究發現，PD具有激動PPARβ受體的作用，可能是一個PPARβ激動

劑［5］。在四氯化碳和高尿酸引起的小鼠肝、腎損傷模型，PD可通過抑制NF-κB-iNOS信號通路產生保護作用，維持機體正常功能［6－7］。但關于PD在糖尿病心肌肥厚中的作用和該作用與PPARβ以及NF-κB-iNOS-NO信號通路的關系未見報道。

故本研究擬利用HGI誘導乳鼠心肌細胞肥大模型，觀察PD對糖尿病心肌肥大的影響，并探討PPARβ及NF-κB-iNOS-NO信號通路在其中可能存在的作用。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1實驗動物 SD乳鼠，清潔級，1～3 d齡，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（渝）2010－0001。

1．1．2主要試劑 PD（白色粉末，HPLC 95%，溶于1%DMSO）、GSK0660、5′-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（5′-Bromo-2-deoxyuridine，5′-BrdU）均購自Sigma-Aldrich；胰蛋白酶、蛋白酶抑制劑、DMSO、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自江蘇碧云天生物工程研究所；DMEM和胎牛血清購自Hyclone；NOS活性及NO含量檢測試劑盒檢均購自南京建成生物工程研究所；TRIzol購自大連寶生物公司；逆轉錄試劑盒和SYBR-Green Supermix購自Bio-Rad；PCR引物由Invitrogen公司負責合成和純化；兔抗大鼠PPARβ、iNOS多克隆抗體購自Cayman Chemical Company；兔抗大鼠phospho-NF-κB p65多克隆抗體購自Cell Signaling Technology；兔抗大鼠GAPDH，山羊抗兔IgG／HRP二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1．2方法

1．2．1心肌細胞培養［3］用胰蛋白酶消化法將乳鼠心室肌消化成單細胞懸液，差速貼壁分離1．5 h。將未貼壁心肌細胞用含20%胎牛血清的DMEM懸浮，調整不同細胞密度，分別接種于6孔板（用于檢測細胞表面積及總蛋白測定）或于25 cm2培養瓶內（用于mRNA提取及檢測），置于37℃、5%CO2培養箱中。18～30 h后見細胞貼壁生長，48 h細胞出現自發搏動。培養初始48 h加入5′-BrdU 0.1 mmol ·L－1抑制非心肌細胞生長，然后更換培養液繼續培養24 h，至72 h換無血清培養液并加入相應藥物，繼續孵育48 h后用于檢測。分組如下：（1）Control組：葡萄糖5.5 mmol·L－1＋甘露醇20.0 mmol· L－1；（2）HGI組：葡萄糖25.5 mmol·L－1＋胰島素0.1 μmol·L－1；（3）、（4）、（5）HGI＋不同濃度PD （0.1、1、10 μmol·L－1）組；（6）HGI＋PD 1 μmol· L－1＋GSK0660 1 μmol·L－1組。

1．2．2心肌細胞表面積測量 取6孔板內長有心肌細胞的玻片，PBS清洗3次后，相差顯微鏡下觀察拍照，應用Image J圖像分析系統（美國國立衛生研究院）測量計算單個細胞的表面積，每張玻片取5個視野，每個視野15～20個細胞，取平均值。每組重復4次。

1．2．3心肌細胞總蛋白測定 將6孔板內培養好的心肌細胞用PBS清洗3次后，置于冰上加入RIPA裂解液，充分攪動裂解5 min后轉至EP管中，超聲破碎3 min，存放于－80℃。BCA法測定總蛋白含量，并根據接種細胞數目計算心肌細胞的蛋白含量。每組重復4次。

1．2．4qRT-PCR法檢測ANF、PPARβ、NF-κB p65、iNOS mRNA的表達 用TRIzol提取心肌細胞總RNA，參照GenBank中大鼠的基因序列設計引物。各引物序列如下：ANF：上游5′-GAGTGAGCCGAGA-CAGCAAA-3′，下游5′-TTGCTCCAATATGGCCTGGG-3′，擴增產物長度122 bp；PPARβ：上游5′-CTG-GCAGAACCCAGTACCAG-3′，下游5′-GTGAGCCG-GTGTCATGGTTA-3′，擴增產物長度111 bp；NF-κB：上游5′-AACGCGTCCAACCTGAAGAT-3′，下游5′-TGTCTGTGAACATCCGTGGG-3′，擴增產物長度188 bp；iNOS：上游5′-TGGTGAGGGGACTGGACTTT-3′，下游5′-CCAACTCTGCTGTTCTCCGT-3′，擴增產物長度101 bp；β-actin：上游5′-GCAGGAGTACGAT-GAGTCCG-3′，下游5′-ACGCAGCTCAGTAACAGT CC-3′，擴增產物長度101 bp。按逆轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA，利用SYBR Green熒光技術，在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀上按照如下反應條件進行擴增：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個循環。以β-actin為管家基因，Ct值（熒光強度到達閾值時的循環數）為統計參數，mRNA的表達倍數采用2ΔCt表示，相對定量法分析結果。每組重復4次。

1．2．5Western blot法檢測PPARβ、phospho-NF-κB p65、iNOS蛋白的表達 取30 μg總蛋白加入含β-巰基乙醇的上樣緩沖液，高溫煮沸10 min使蛋白變性，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF轉膜，BSA封閉1 h，加入不同一抗（PPARβ抗體1∶200稀釋，其它一抗均1∶1 000稀釋），4℃過夜，加辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000稀釋）。洗膜后用ECL發光液（Advanstor公司）顯色，凝膠成像儀與Image Lab軟件（Bio-Rad）照相顯影，分析結果。每組重復4次。

1．2．6NOS活性及NO含量檢測 取30 μL上清

液，按照試劑盒說明書操作，分別在530 nm和570 nm波長下測定吸光度（A值），根據公式［總NOS活力（kU·L－1）＝（總NOS活力測定管A－空白管A）×26.1／0.383×1.5］計算NOS活性，或根據標準曲線計算NO含量。每組重復3次。

Fig 1 Morphological changes of cardiomyocytes （200×）

1．3統計學處理 應用SPSS 16．0統計軟件對數據進行分析整理，數據均采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，用Excel和GraphPad Prism 5．01等軟件作圖。

2　結果

2．1PD對糖尿病心肌肥大的作用 細胞形態學檢測可見，加入HGI后，心肌細胞明顯增大（Fig 1），細胞表面積、總蛋白含量和ANF mRNA表達亦明顯增加（P＜0.01）（Tab 1），提示心肌細胞肥大。若以平均值計算，HGI處理后，細胞表面積增加了3.49倍，蛋白含量增加了1.99倍，ANF mRNA表達增加了3.89倍。

Tab 1 Effects of polydatin（PD）on the hypertrophic cardiomyocytes induced by glucose at 25．5 mmol·L－1and insulin at 0．1 μmol·L－1（HGI）（±s，n＝4）

Tab 1 Effects of polydatin（PD）on the hypertrophic cardiomyocytes induced by glucose at 25．5 mmol·L－1and insulin at 0．1 μmol·L－1（HGI）（±s，n＝4）

**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs HGI；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs HGI＋PD（1 μmol·L－1）．

Group Cell surface area （μm2／cell）Protein level （μg／106cells）ANF mRNA level Control　258．9±47．9　16．8±2．8　0．97±0．24 HGI　903．3±149．7**33．4±7．3**3．77±0．48**HGI＋PD（0．1 μmol·L－1）　438．8±33．3＃＃　25．6±2．3＃　　—HGI＋PD（1 μmol·L－1）　404．0±25．2＃＃　24．3±1．9＃　2．00±0．21＃＃HGI＋PD（10 μmol·L－1）　378．2±34．4＃＃　20．9±2．9＃＃　　—HGI＋PD＋GSK0660（1 μmol·L－1）　902．1±104．1▲▲33．5±7．0▲3．80±0．33▲▲

與HGI組比較，PD（0.1，1及10 μmol·L－1）明顯抑制HGI誘導的心肌細胞表面積和總蛋白含量的增加，其抑制率分別為51.3%、55.2%、58.0% （P＜0.01）和22.2%、26.2%、36.5%（P＜0.01）。PD 1 μmol·L－1明顯抑制HGI誘導的ANF mRNA的表達，使其減少了48.0%（P＜0.01）。這些結果提示PD能夠改善HGI誘導的心肌細胞肥大。PPARβ阻斷劑GSK0660 1 μmol·L－1完全阻斷等摩爾濃度的PD對HGI誘導的心肌肥大的作用（P＜0.01），各指標基本接近HGI模型組水平（P＞0.05）。

2．2PD對HGI誘導心肌細胞PPARβ、NF-κB p65、iNOS mRNA以及蛋白含量的影響 與對照組比較，在HGI作用下，PPARβ的mRNA和蛋白表達分別降低了8.3%和38.1%（P＜0.05）。而NF-κB p65、iNOS mRNA及蛋白的表達明顯上升，分別增加了172.6%、390.1%（P＜0.01）和60.8%、104.9% （P＜0.01）。PD 1 μmol·L－1明顯逆轉HGI下調的PPARβ mRNA和蛋白表達（P＜0.05），使PPARβ表達明顯增加，甚至高于正常對照組（P＜0.01）；同時，PD亦明顯減少HGI上調的NF-κB p65、iNOS mRNA和蛋白表達（P＜0.01）。GSK0660（1 μmol· L－1）完全取消等摩爾濃度的PD的上述作用，使PPARβ、NF-κB p65和iNOS的表達均接近于HGI誘導時的水平（P＞0.05）（Fig 2，Fig 3）。

2．3PD對HGI誘導心肌細胞NOS活性及NO含量的作用 加入HGI后，心肌細胞的NOS活性升高，NO含量亦明顯上升，較正常組分別增加了31.2%和65.0%（P＜0.01）（Fig 4）。PD（1 μmol· L－1）明顯降低NOS活性和NO含量（P＜0.01），二者較HGI組分別下降了24.2%和21.5%。GSK0660（1 μmol·L－1）完全阻斷PD對NOS活性和NO含量的調節作用（P＜0.05），使二者基本接近HGI模型組水平（P＞0.05）。

3　討論

2型糖尿病人群研究表明，糖尿病患者心臟左心室壁厚度、室腔及重量日益增加，出現左心室肥

大。同時，心臟舒張期順應性降低，射血分數減少，舒張功能障礙，繼而出現收縮期功能障礙［8］。心肌肥厚是糖尿病患者常見的心血管并發癥。本實驗采用葡萄糖25．5 mmol·L－1和胰島素0.1 μmol·L－1模擬糖尿病時高糖高胰島素血癥環境，建立糖尿病心肌肥厚離體細胞模型。結果顯示，心肌細胞表面積、總蛋白含量和心肌肥厚標志性基因ANF mRNA表達均明顯增加，提示HGI誘導出現心肌細胞肥大。

Fig 2 Effects of PD on mRNA expressions of PPARβ，NF-κB p65 and iNOS in cardiomyocytes induced by glucose at 25．5 mmol·L－1and insulin at 0．1 μmol·L－1（HGI）（±s，n＝4）

Fig 3 Effects of PD on protein expressions of PPARβ，p-NF-κB p65 and iNOS in cardiomyocytes induced by glucose at 25．5 mmol·L－1and insulin at 0．1 μmol·L－1（HGI）（±s，n＝4）

Fig 4 Effects of PD on the NOS activity（A）and NO concentration （B）in the cardiomyocytes induced by glucose at 25．5 mmol·L－1and insulin at 0．1 μmol·L－1（HGI）（±s，n＝3）

PD是從傳統中藥虎杖中提取的有效單體，在紅葡萄酒、啤酒花、花生、巧克力等許多日常食物中含量豐富。目前的研究顯示，PD對血管緊張素Ⅱ或苯腎上腺素誘導的心肌肥大具有明顯保護作用［9－10］，但對糖尿病引起的心肌肥大尚未見報道。本實驗結果顯示，PD明顯減少HGI誘導增加的細胞表面積和蛋白總量，并減少ANF mRNA表達，提示PD對糖尿病心肌肥大可能也具有保護作用。

目前，糖尿病心肌肥厚的發病機制并不完全清楚。大量研究發現，肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病等的發生均與慢性輕度炎癥密切相關［11］。作為PPARs家族一員，PPARβ參與了代謝、炎癥、增殖和

分化等基因的調控。研究報道，PPARβ參與調節苯腎上腺素誘導的心肌肥大［12］；我們之前的研究發現，PPARβ也參與了糖尿病心肌肥大過程［3］。本實驗結果顯示，在HGI的作用下，模型組PPARβ在mRNA及蛋白水平表達均明顯降低；給予PD干預后，PPARβ的表達則明顯升高，甚至高于正常對照組，提示PD的作用可能是通過激動PPARβ來實現的。PPARβ特異性阻斷劑GSK0660完全取消PD對心肌肥大的改善作用，同時使PPARβ表達恢復至HGI模型組水平，從另一個方面再次證實PD抗糖尿病心肌肥大的作用可能與其對PPARβ相關信號通路的激活有關。

在苯腎上腺素誘導的心肌肥大中，PPARβ激活后，可抑制NF-κB表達，從而保護心肌細胞［13］；在感染性休克小鼠和肺癌細胞培養中也有類似發現，PPARβ激活調控NF-κB及其下游細胞因子的表達，保護組織器官的正常功能［14－15］。反之，在PPARβ基因敲除小鼠的心臟，NF-κB及IL-1β等炎性因子表達明顯升高［4］。這些結果提示，NF-κB可能是PPARβ作用的下游因子。作為重要的炎癥調節介質，NF-κB能夠調節多種參與炎癥免疫反應的細胞因子和炎癥介質的基因轉錄，iNOS是其重要的下游因子之一，在炎癥反應和氧化應激中起關鍵作用［16－18］。iNOS在正常的組織細胞中表達量很低；當受到內毒素、細胞因子等刺激后iNOS表達增加，合成大量NO。過量增加的NO是重要內源性炎癥介質，參與炎癥、氧化應激、高血壓等多種心血管疾病相關的病理過程，在糖尿病慢性并發癥中具有重要作用［15］。在DCM病變中，NF-κB-iNOS信號通路激活則加重心肌組織損傷［18］。本實驗條件下，HGI作用使PPARβ表達被抑制，NF-κB則被激活，iNOS的表達量明顯增加，NOS活性和NO含量隨之增加，提示PPARβ-NF-κB-NO通路在糖尿病心肌肥大中亦具有重要作用。在小鼠高尿酸血癥腎病模型和四氯化碳誘導的肝損傷模型，PD能有效抑制NF-κB、iNOS及IL-1β等多種炎性因子的表達，發揮抗炎抗氧化作用，維持腎組織和肝臟的正常功能［6－7］。在高糖作用的大鼠腎小球系膜細胞，PD亦顯示了明顯的保護作用，該作用與其對NF-κB信號通路的抑制密切相關［19］。那么，PD糖尿病心肌肥大保護作用與NF-κB-iNOS-NO信號通路關系如何？目前未見報道。本研究結果顯示，PD激活PPARβ表達同時，NF-κB的活化被抑制，iNOS的表達降低，NOS活性下降，NO釋放減少，提示PD的抗糖尿病心肌肥大作用可能是通過激活PPARβ受體，抑制NF-κB-iN- OS-NO信號通路的轉導產生的。PPARβ受體阻斷劑GSK0660取消PD糖尿病心肌肥大保護作用同時，完全取消PD對上述因子的作用，使PPARβ表達下降，NF-κB、iNOS表達、NOS活性和NO含量均恢復至HGI誘導水平，從另一個方面再次證實PPARβ-NF-κB-iNOS-NO信號通路在PD的抗糖尿病心肌肥大中可能具有重要作用。

綜上所述，PD能有效抑制HGI誘導的心肌細胞肥大，其機制可能是通過激活PPARβ，抑制NF-κB，下調iNOS表達，最終減少NO過量生成而實現的。但PD在糖尿病心肌肥厚中的確切作用尚需整體動物模型證實及臨床研究的進一步驗證，其作用是否還有其它信號通路參與，亦需進行更深入的研究。

（致謝：本實驗在重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室完成，感謝實驗室各位老師和同學在實驗中提供的幫助。）

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PPARβ-related signal pathway involves in the effect of polydatin on high glucose-and insulin-induced cardiomyocyte hypertrophy

HUANG Bo1，JIANG Fen2，XUE Lai1，WU Yang1，DU Wei-min1，QIU Hong-mei1，JIANG Qing-song1
（1．Dept of Pharmacology，Chongqing Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2．Population and Family Planning Service Center，Qichun Hubei 436300，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of polydatin on cardiomyocyte hypertrophy induced by high glucose （25.5 mmol·L－1）and insulin（0.1 μmol·L－1）（HGI）and its possible influence on peroxisome prolif-erator-activated receptor-β（PPARβ）／nuclear tran-scription factor-κB（NF-κB）／nitric oxide（NO）signa-ling pathway．Methods The cardiomyocyte hypertro-phy was characterized in rat primary cardiomyocytes by measuring the cell surface area，protein content，and atrial natriuretic factor（ANF）mRNA expression．The mRNA and protein expressions were measured by qRT-PCR and Western blotting，respectively．The activity of NO synthase（NOS）and NO content were measured by reagent kit through ultraviolet spectroscopy．Results

HGI significantly induced cardiomyocyte hypertrophy which increased the cell surface area，protein content and ANF mRNA expression（P＜0.01）．Meanwhile，the expressions of PPARβ mRNA and protein reduced while the NF-κB p65 and iNOS expressions increased significantly which occurred in parallel with rising NOS activity and NO concentration（P＜0.01）．Polydatin （0.1，1，10 μmol·L－1）inhibited the cardiomyocyte hypertrophy induced by HGI（P＜0.01），and re-versed the mRNA and protein expressions of PPARβ，NF-κB p65 and iNOS，and NOS activity，as well as NO content．These effects of polydatin were abolished by GSK0660（1 μmol·L－1），a selective PPARβ an-tagonist（P＜0.05）．Conclusion Polydatin resists HGI-induced cardiomyocyte hypertrophy，which may be mediated by PPARβ up-regulation，and then NF-κB-iNOS-NO pathway inactivation．

Key words：polydatin；cardiomyocyte hypertrophy；high glucose and insulin；PPARβ；NF-κB；NO；dia-betes mellitus

作者簡介：黃 波（1992－），男，碩士，研究方向：心血管藥理學，E-mail：1050678290＠qq．com；蔣青松（1972－），女，博士，教授，研究方向：心血管藥理學，通訊作者，Tel：023-68485161；E-mail：cqjiangqs＠hot-mail．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81100905）

收稿日期：2015－04－02，修回日期：2015－06－23

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1264－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．017