干擾素誘導的雙鏈RNA依賴性蛋白激酶體外抗乙型肝炎病毒活性的研究

王愛華，管世鶴，楊 凱，張 浩，孫蓓蓓，潘 穎，沈繼龍

（安徽醫科大學1．第二附屬醫院檢驗科、2．人獸共患病安徽省重點實驗室，安徽合肥 230601）

干擾素誘導的雙鏈RNA依賴性蛋白激酶體外抗乙型肝炎病毒活性的研究

王愛華1，管世鶴1，楊 凱1，張 浩1，孫蓓蓓1，潘 穎1，沈繼龍2

（安徽醫科大學1．第二附屬醫院檢驗科、2．人獸共患病安徽省重點實驗室，安徽合肥 230601）

中國圖書分類號：R342.2；R345.57；R373.21；R392.11；R977.3；R977.6

摘要：目的 構建表達雙鏈RNA依賴性蛋白激酶（PKR）融合綠色增強熒光蛋白（pEGFP-PKR）真核表達質粒，并進一步研究PKR蛋白在體外抗乙型肝炎病毒（HBV）活性。方法以pEGFP-N1為空載體，運用分子克隆技術構建重組質粒pEGFP-PKR，通過雙酶切和直接測序兩種方法驗證重組質粒pEGFP-PKR是否構建成功。以能分泌完整HBV病毒顆粒子的肝胚瘤細胞株HepG2.2.15細胞為細胞模型，采用重組質粒轉染方式處理HepG2.2.15細胞，運用熒光顯微鏡觀察融合蛋白pEGFP-PKR在細胞內的表達，以電化學發光方法和實時熒光定量PCR技術分析細胞上清HBV抗原表達和細胞病毒復制水平。結果 酶切鑒定和序列分析證實成功構建重組質粒pEGFP-PKR，轉染HepG2.2.15細胞后在熒光顯微鏡下可見融合蛋白pEGFP-PKR表達，同時細胞分泌的HBV抗原與空載體組相比較明顯下降（P＜0.05），而細胞外HBV復制水平未見明顯變化。結論 在體外肝細胞模型中，PKR蛋白具有一定的抗HBV活性作用。

關鍵詞：肝炎病毒；乙型；質粒；PKR蛋白；抗原；復制；細胞

網絡出版時間：2015－8－10 14：37 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．015．html

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種嗜肝DNA病毒，HBV感染導致的慢性乙型肝炎對人類健康造成嚴重的危害，據報道［1－2］，HBV具有一定的致癌性，隨著病程的進展，慢性乙型肝炎可以發展為肝硬化，甚至肝細胞癌。臨床上治療慢性乙型肝炎首選的藥物是IFN-α，IFN-α通過與細胞膜上的受體結合誘導表達抗病毒蛋白：如抗粘液病毒蛋白A（MxA）、蛋白激酶（PKR）、2′，5′-寡腺苷酸合成酶（2′，5′-OAS）等發揮抗病毒作用。然而，IFN-α治療慢性乙型肝炎的療效并不理想，僅有約1／3的患者有效，但具體機制尚不明。在本課題組前期研究中發現，HBV及其抗原成分能通過多種途徑拮抗IFN-α的抗HBV活性［3－4］，其中能被HBV核心蛋白抑制的IFN-α抗病毒蛋白MxA在體外具有抗HBV活性［5］。PKR蛋白是IFN-α誘導的另一種重要抗病毒蛋白。研究表明［6］，在體外肝癌細胞模型中，HBV X蛋白的表達被抑制后，PKR蛋白的表達增加，同時HBV的復制減弱。然而，針對PKR蛋白是否能夠抑制HBV活性目前尚不清楚。為此，筆者以能夠分泌HBV病毒顆粒子的HepG2.2.15細胞為細胞模型，通過構建表達PKR蛋白融合綠色增強熒光蛋白（pEGFP-PKR）真核表達質粒轉染HepG2.2.15細胞，分析轉染前后細胞外HBV抗原分泌和病毒復制水平，以探討PKR蛋白體外抗HBV活性，為研發新型制劑治療慢性乙型肝炎提供一定實驗依據。

1　材料與方法

1．1材料來源 HepG2.2.15細胞由本實驗室保存，細胞以含10%胎牛血清的DMEM培養液常規傳代培養。質粒pEGFP-N1購自美國Clon-tech公司；PKR基因序列由上海金斯瑞生物科技有限公司合成；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑盒購自上海復星長征醫學科學有限公司；電化學發光試劑盒購自羅氏診斷產品上海有限公司。

1．2pEGFP-PKR質粒構建 從Pubmed上查找人源性基因PKR（GenBank：M852 94）的mRNA基因序列，并分別在5′端加上Xhol酶切位點（CTC-GAG）、3′端加上BamHI酶切位點（GGATCC），基因序列由上海金斯瑞生物科技有限公司合成。構建過程如下：基因合成產物8 μL，T載體1 μL，solutionⅠ9 μL，4℃連接過夜。將連接產物全量轉入感受態大腸埃希菌DH5α中，涂于含氨芐霉素的培養板中，并置于37℃溫箱中培養過夜。無菌接種環挑取4個單克隆菌落小量擴菌，按照質粒抽提步驟提取質粒。取質粒8 μL、Xhol酶0.5 μL、BamHⅠ0.5 μL，

10×HBuffer 1 μL，37℃酶切2 h，然后瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到目的基因與T載體連接產物。空載體pEGFP-N1行雙酶切，純化回收凝膠產物。pEG-FP-N1 3 μL、目的基因與T載體連接產物13 μL、T4DNA連接酶2 μL、buffer 2 μL，共20 μL，于4℃連接過夜，將產物全量轉入DH5α中，涂于含卡那霉素的培養板中，培養過夜。挑取陽性克隆抽提質粒，行雙酶切、PCR鑒定，DNA測序，最終得到pEGFP-PKR真核表達質粒。

1．3實驗分組 將HepG2.2.15細胞分3組，空白對照組：細胞不做相關處理，空載體組：轉染空載體pEGFP-N1，PKR轉染組：轉染重組質粒pEGFP-PKR，每組設立3個平行對照。

1．4質粒轉染 HepG2.2.15細胞復蘇后用10%胎牛血清，以DMEM為基礎培養基，并補充2 mmol ·L－1谷胺酰胺、1×105U·L－1青霉素、1×105U· L－1鏈霉素、于5%CO2、37℃孵育箱培養。HepG2.2.15細胞用6孔板培養，待細胞生長到70%～80%融合時，以LipofectamineTM2000為脂質體，將不同濃度的重組質粒pEGFP-PKR（0、2、4、6 mg·L－1）瞬時轉染于HepG2.2.15細胞，36 h后檢測上清液中HBV抗原的表達變化；以4 mg·L－1的重組質粒pEGFP-PKR轉染HepG2.2.15細胞，在轉染后不同的時間點（24、36、48 h），運用熒光顯微鏡觀察融合蛋白EGFP-PKR在細胞內的表達情況及上清液中HBV抗原的表達變化。

1．5熒光定量PCR檢測細胞上清液中HBV DNA的表達 在質粒轉染36 h后，收集各HepG 2.2.15細胞上清液，以熒光定量PCR試劑盒檢測上清液中HBV DNA的量。具體步驟如下：取50 μL細胞上清液，加入50 μL核酸提取液A，振蕩混勻10 s，12 000 ×g離心10 min，棄上清；然后加入50 μL核酸提取液B至沉淀中，振蕩混勻10 s，100℃保溫10 min，12 000×g離心2 min。取處理上清液7 μL、HBV PCR緩沖液30 μL、MgCl25 μL、熒光探針5 μL、Taq 酶3 μL，共50 μL于反應管中，低速離心數秒，取出置于PCR儀器。應用Mx3000P PCR儀器進行熒光定量檢測，反應條件為：94℃預變性5 min，93℃30 s，60℃90 s，共循環40次，反應結束后由軟件分析計算出HBV DNA的拷貝數。

1．6電化學發光法檢測HepG2.2.15細胞分泌的HBV HBsAg和HBeAg 分別收集不同時間點各組細胞上清液，以1 200 r·min－1離心10 min以去除細胞碎片，收集的上清液按照電化學發光試劑說明書檢測HBsAg和HBeAg。

1．7統計學處理 用SPSS 13.0統計軟件進行分析，數據用±s表示，采用t檢驗和單因素方差分析。

2　結果

2．1真核表達質粒pEGFP-PKR的鑒定 將pEG-FP-PKR質粒送至上海生物工程公司測序，證實重組質粒構建正確，插入的目的基因與PKR（Gen-Bank：M85294）比較，核酸同源性為99%，見Fig 1A。重組質粒pEGFP-PKR行Xhol酶、BamHⅠ雙酶切后，雙酶切分別得到1668 bp大小的目的片段和4651 bp大小載體，所得片段大小與預期相符合，如Fig 1B。

Fig 1 Results of pEGFP-PKR sequencing and enzyme digestion

2．2真核表達質粒pEGFP-PKR在HepG2.2.15細胞中表達情況 質粒pEGFP-PKR轉染HepG2.2.15細胞24 h后，在熒光顯微鏡下即可觀察到綠色熒光，轉染36 h綠色熒光強度最強，即抗病毒蛋白PKR在HepG2.2.15細胞中表達最強（Fig 2A）。且以胞質表達為主，細胞核也有微量表達（Fig 2B）。

2．3PKR蛋白對HepG2.2.15細胞外HBV抗原分泌的影響 將不同濃度的重組質粒pEGFP-PKR（0、2、4、6 mg·L－1）瞬時轉染于HepG2.2.15細胞36 h后，電化學發光分析顯示，與0 mg·L－1pEGFP-PKR轉染劑量組相比，其它劑量轉染組細胞外HBsAg和HBeAg分泌量均有明顯下降（P＜0.05），隨著轉染質粒pEGFP-PKR濃度的增加，HepG2.2.15細胞HBV

抗原分泌逐步降低，其中4 mg·L－1抑制效果最為明顯，差異具有統計學意義（P＜0.01），如Fig 3所示。將4 mg·L－1質粒pEGFP-PKR瞬時轉染于HepG2.2.15細胞中，在轉染后不同的時間點（0、24、36、48 h）檢測細胞上清液HBV抗原的分泌，結果顯示：空載體組與空白組相比，HBV抗原分泌無明顯變化（P＞0．05）；與空載體組相比，隨著轉染時間延長，PKR轉染組HBV抗原的分泌量逐漸下降（P＜0.05），其中轉染后36 h對HBsAg的抑制作用最強（P＜0.01），對HBeAg的抑制作用在轉染后48 h最強（P＜0.01），如Fig 4所示。

Fig 2 Expression of pEGFP-PKR fusion protein in HepG2.2.15 cells observed by fluorescent microscope

Fig 3 Effects of different doses of plasmid pEGFP-PKR transfection on HBV antigen secretion

2．4PKR蛋白對HepG2.2.15細胞外HBV復制的影響 應用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）分析發現，與空白對照組比較，各處理組對HepG2.2.15細胞上清液中HBV DNA無明顯抑制作用（P＞0.05），見Fig 5。

3　討論

IFN-α作為一種重要的細胞因子，具有抗病毒、抗細胞增殖和免疫調節等多種生物學功能，是臨床治療乙型肝炎的首選藥物。然而，臨床上運用

IFN-α治療乙型肝炎的療效不甚理想，因此，尋找和研發新型的治療HBV感染的藥物和蛋白制劑非常必要。

Fig 4 Effects of pEGFP-PKR transfection on secretion of HBV antigen in different time

Fig 5 Expression of HBV DNA in supernatant of HepG2.2.15 cells by real-time fluorescence quantitative PCR

有研究報道［7－9］，PKR作為干擾素可誘導的環腺苷酸非依賴性絲氨酸／蘇氨酸激酶，其N端dsRBM與病毒誘導的dsRNA在細胞內相結合后，進而誘發PKR的底物蛋白eIF-2磷酸化修飾，干預病毒基因進入宿主細胞核糖體環節，最終發揮抑制病毒復制的作用。PKR是干擾素誘導的一種重要的抗病毒蛋白，在IFN-α的抗HBV效應中發揮了極其重要的作用［10］。HBV是一種嗜肝病毒，感染肝細胞后本身并不引起肝細胞損傷，而是由于特異和非特異的免疫細胞攻擊作用導致肝細胞損傷，若能尋找到在肝細胞內有效抑制HBV復制抗病毒蛋白，這對于慢性乙型肝炎的治療將具有積極的意義。結合課題組前期研究結果，我們推測PKR作為一種干擾素誘導的重要廣譜抗病毒蛋白，很可能對HBV抗原分泌或病毒復制具有一定抑制作用。為此，在本研究中，通過構建表達PKR蛋白的綠色增強熒光蛋白-PKR（pEGFP-PKR）真核表達質粒，將其轉染能分泌完整HBV病毒顆粒子的肝胚瘤細胞株HepG2.2.15細胞，分析轉染前后不同時間點和轉染劑量對肝細胞外HBV抗原分泌和病毒復制水平影響，以研究PKR蛋白體外是否具有抗HBV活性。結果顯示，抗病毒融合蛋白PKR主要在HepG2.2.15細胞胞質表達，細胞核有微量表達，隨著轉染質粒pEGFP-PKR劑量的增多，HepG2.2.15細胞HBV抗原分泌逐步降低，直至4 mg·L－1抑制效果最為明顯，而在6 mg·L－1對HBV抗原抑制效果不如4 mg·L－1，很可能是由于高劑量轉染濃度增加轉染試劑對肝細胞的細胞毒作用。然而，HepG2.2.15細胞上清液中HBV復制水平并未有明顯變化，這與我們前期報道IFN抗病毒蛋白脫離宿主體內免疫系統的參與會影響其抗病毒活性的結論是一致的［11］。此外，PKR抗病毒蛋白抗HBV活性也呈現一定時間依賴性，隨著轉染時間延長，PKR抗病毒蛋白抗HBV活性逐步升高，其中轉染后36 h 對HBsAg的抑制作用最強，對HBeAg的抑制作用在轉染后48 h最強。然而本研究中，PKR轉染組HBV DNA與對照組相比差異無統計學意義，這與體內有關抗病毒蛋白具有較好的抗HBV活性報道不相符，可能是由于抗病毒蛋白對HBV DNA復制的抑制作用需要體內免疫系統的參與，而體外細胞模型缺乏體內復雜的免疫調節系統，因此不能表現出良好的抗HBV復制作用。

本研究表明，在體外，PKR蛋白具有一定獨立的抗HBV活性，且主要在肝細胞胞質發揮作用，本研究為PKR蛋白的抗病毒作用及臨床運用PKR蛋

白制劑治療慢性乙型肝炎提供實驗依據，但是如何讓體外實驗在人體內得到驗證還需要進一步的探討，下一步的研究擬以感染HBV的小鼠為動物模型，在體內驗證PKR蛋白是否能夠有效的發揮抗HBV活性。隨著進一步的研究，PKR蛋白可望單獨或與其它抗病毒藥物（如IFN-α）一起運用于乙型肝炎的臨床治療，為乙肝病人提供新的治療選擇。

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Study of IFN-inducible double-stranded RNA dependent protein kinase on antiviral activity of HBV in vitro

WANG Ai-hua1，GUAN Shi-he1，YANG Kai1，ZHANG Hao1，SUN Bei-bei1，PAN Ying1，SHEN Ji-long2
（1.Dept of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601，China；2．Anhui Key Laboratories of Zoonoses，Anhui Medical University，Hefei 230601，China）

Abstract：Aim To construct and express the eukary-otic expression vector of double-stranded RNA-depend-ent protein kinase（PKR）fusion green fluorescent and analyse its antiviral activity of HBV in vitro．Methods The PKR gene was cloned into an empty expression vector pEGFP-N1 using molecular clone technology．After being confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing methods，the recombinant plasmid was named as pEGFP-PKR that was subsequently transfect-ed into HepG2.2.15 cells using LipofectamineTM2000．The expression level of PKR in HepG2.2.15 cells was confirmed by using fluorescent microscopy．Mean-while，HBV DNA and HBsAg／HBeAg were detected by real-time PCR and electrochemiluminescence meth- od，respectively．Results Both restriction enyme di-gestion and sequencing assays showed that the recombi-nant vector pEGFP-PKR was successfully constructed in our study．Fluorescent microscopy observation indi-cated that the fusion protein pEGFP-PKR expressed ef-ficiently in HepG2.2.15 cells．Moreover，compared with the empty vector group，the expression of HBV antigen in supernatants was significantly decreased（P ＜0.05）．However，the extracellular HBV DNA ex-pression was not inhibited significantly．Conclusion In vitro，PKR proteion has certain antiviral activity of HBV．

Key words：hepatitis B virus；plasmid；PKR protein；antigen；complication；cells

作者簡介：王愛華（1985－），女，碩士，檢驗師，E-mail：314wcy＠163．com；管世鶴（1972－），男，博士，教授，主任技師，博士生導師，通訊作者，E-mail：shiheguan＠126．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81171662）

收稿日期：2015－05－09，修回日期：2015－06－29

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1254－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．015