基因重組心肌肌鈣蛋白I融合蛋白的抗腫瘤效應

雷光強，劉朝陽，姜懿納，李金萍，曹勤燕，李 濤，劉鳳鳴

（1．廣西藥用植物研究所，廣西南寧 530024；2．中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所，北京 100021；3．湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南長沙 410208；4．常州大學制藥與生命科學學院，江蘇常州 213016；5．中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，北京 100050）

基因重組心肌肌鈣蛋白I融合蛋白的抗腫瘤效應

雷光強1，劉朝陽2，姜懿納3，李金萍4，曹勤燕1，李 濤5，劉鳳鳴1

（1．廣西藥用植物研究所，廣西南寧 530024；2．中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所，北京 100021；
3．湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南長沙 410208；4．常州大學制藥與生命科學學院，江蘇常州 213016；5．中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，北京 100050）

中國圖書分類號：R-332；R322．12；R329．24；R364．3；R73-35；R977．6

摘要：目的 研究基因重組心肌肌鈣蛋白I與人工短肽的融合蛋白（CIS）對腫瘤生長的作用。方法 用MTT法觀察CIS體外對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）生長的作用。利用雞胚絨毛尿囊膜模型觀察CIS對新生血管生長的影響。用6種小鼠腫瘤異位可移植模型觀察CIS在體內(nèi)對腫瘤生長的作用。結果 CIS對HUVEC細胞增殖具有明顯抑制作用，并呈劑量依賴關系；雞胚絨毛尿囊膜實驗顯示，CIS濃度為5、10 mg·L－1時，新生血管生成的數(shù)量明顯減少；荷瘤鼠體內(nèi)異位移植模型實驗顯示：CIS（10 mg·kg－1）處理組腫瘤生長緩慢，瘤體明顯小于模型對照組，對S180腫瘤瘤重抑制率85.3%，對Lewis肺癌腫瘤瘤重抑制率87.0%，對H22肝癌腫瘤瘤重抑制率84.2%，對人小細胞肺癌H446腫瘤瘤重抑制率60.42%，對人可移植性肝癌SMMC7721腫瘤瘤重抑制率61.62%，對人胃低分化腺癌BGC823腫瘤瘤重抑制率為41.84%。結論 CIS在體外抑制HUVEC細胞的生長，在雞胚絨毛尿囊膜實驗中，CIS對新生血管生成有明顯的抑制作用。在體內(nèi)，CIS融合蛋白可有效抑制小鼠可移植腫瘤細胞的生長。CIS抗腫瘤效應很可能是通過抑制腫瘤組織中血管內(nèi)皮細胞的增殖，進而減少腫瘤組織中新生血管生成的數(shù)量而達到的。

關鍵詞：基因重組心肌肌鈣蛋白融合蛋白；人臍靜脈內(nèi)皮細胞；雞胚絨毛尿囊膜；移植瘤；腫瘤抑制作用；血管生成抑制劑；裸鼠

網(wǎng)絡出版時間：2015－10－16 9：52 網(wǎng)絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．040．html

存在于肌組織中的76 ku的肌鈣蛋白三聚體（troponin，Tn），主要參與調(diào)節(jié)肌肉收縮。它由3種亞基組成，分別是肌鈣蛋白I（TnI，21 ku）、肌鈣蛋白T（TnT，37 ku）和肌鈣蛋白C（TnC，18 ku）。近十多年來，從非肌組織中提取的這3種蛋白亞基的功能學研究倍受重視。Moses等［1］于1999年首次從軟骨組織中純化提取出了TnI，并利用基因重組的人TnI在體外證實其具有抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVEC）增生的作用。同時，人TnI在雞胚絨毛尿囊膜和小鼠角膜新生血管生成實驗模型中，具有抑制新生血管生成作用，重組人TnI在B16小鼠惡性黑素瘤肺轉移模型中，明顯地抑制瘤細胞肺轉移速率。隨后，F(xiàn)eldman等［2］于2002年發(fā)現(xiàn)人TnI抑制血管內(nèi)皮細胞增生的作用機制是通過與細胞bFGF競爭bFGF受體的結合。Kern等［3］找到TnI的活性位點，位于其氨基酸序列94－123的肽段具有抑制內(nèi)皮細胞管腔形成、減少內(nèi)皮細胞分裂、下調(diào)內(nèi)皮細胞ICAM-1的表達、下調(diào)由CAPAN-1細胞所產(chǎn)生的VEGF-A的作用，抑制胰腺癌細胞的肝轉移。Schmidt等［4］利用穩(wěn)定轉染的Morris肝癌細胞系（MH3924A）過量表達人TnI，與HUVEC共同培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)過量表達的人TnI可減少HUVEC細胞的增殖速率，并增加HUVEC細胞的凋亡。同時，小鼠皮下荷瘤實驗表明，肝癌細胞系中TnI的過量表達可減少腫瘤細胞的增生，促進腫瘤細胞的凋亡而抑制腫瘤細胞的生長。有研究表明，鯊魚TnI也有抑制新生血管生成及腫瘤生長的作用［5－9］，鯊魚TnI與人源TnI有68.9%的同源性，其中活性多肽（Lys91-Leu123）與人源TnI有78.8%的同源性。基于上述研究，我們試圖尋找具有臨床應用前景的，可阻斷腫瘤血管發(fā)生，進而減緩或阻斷腫瘤細胞生長的人源骨骼肌型肌蛋白。本工作利用北京億利高科生物工程技術研究所克隆重組的以人心肌組織的TnI為母板，以人工短肽為融合序列合成的融合蛋白（簡稱CIS），在體外大腸桿菌中高效表達純化后，采用體外細胞學實驗、雞胚絨毛尿囊膜實驗以及體內(nèi)小鼠荷瘤動物模型實驗，檢測CIS對腫瘤細胞生長的作用及其可能作用機制，為進一步探究此融合蛋白的

抗癌藥效奠定研究基礎。

1　材料與方法

1．1試劑與藥品 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Hyclone公司。MTT、DMSO購自于Sigma公司。貝伐珠單抗注射液（安維汀，Avastin injection）人源化抗-VEGF單克隆抗體，羅氏制藥有限公司產(chǎn)品，2～8℃冷藏避光保存，進口注冊標準JS20050034。

1．2細胞 人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）細胞株購自于解放軍軍事醫(yī)學科學院。S180腹水瘤細胞株、Lewis肺癌細胞株、H22肝癌細胞株由北京中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所提供。人小細胞肺癌H446細胞株、人可移植性肝癌SMMC7721細胞株、人胃低分化腺癌BGC823細胞株由北京中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所提供。

1．3實驗小鼠 昆明小鼠、C57BL小鼠、ICR小鼠、Balb／c裸鼠16～18 g，SPF級，中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，實驗動物質(zhì)量合格證號SCXK（京）2009－0004。

1．4方法

1．4．1人心肌肌鈣蛋白融合蛋白（CIS）體外表達純化 本實驗研究制品由北京億利高科生物工程技術研究所提供，是以心肌肌鈣蛋白I亞基為母板，以人工短肽為融合序列而合成的融合蛋白（CIS），構建于PET21a載體中，原核表達產(chǎn)物為29 ku的蛋白，SDS-PAGE法檢測，結果對灰度值進行計算。CIS為體外表達并經(jīng)過層析柱純化的產(chǎn)物，除蛋白質(zhì)外，不含有其它大分子物質(zhì)，CIS蛋白質(zhì)純度為96.7%，溶劑為20 mmol·L－1PBS（150 mmol·L－1NaCl），pH 7.4的緩沖液。

1．4．2體外培養(yǎng)HUVEC增殖抑制實驗 實驗分為空白對照組、生理鹽水對照組和CIS實驗組（CIS 3組不同濃度）。HUVEC細胞按內(nèi)皮細胞常規(guī)法進行培養(yǎng)，將培養(yǎng)生長正常的HUVEC細胞按每孔5× 104細胞分別接種于96孔板，37℃培養(yǎng)12 h后，換含有不同濃度CIS的新鮮培養(yǎng)液，空白對照換含有等體積生理鹽水的新鮮培養(yǎng)液。37℃培養(yǎng)24 h和48 h，然后用MTT法測定細胞增殖狀態(tài)。取出96孔培養(yǎng)板，每孔加入MTT溶液（5 g·L－1）20 μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解，選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔的吸光值。計算CIS對細胞增殖的影響。抑制率／%＝吸光值（CIS）／吸光值（生理鹽水對照組）×100%。

1．4．3雞胚絨毛尿囊膜實驗 將30只種蛋置于（37±0.5）℃培養(yǎng)箱孵育，d 3剝開雞蛋外殼，將發(fā)育中的雞胚轉移入無菌培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。隨即將雞胚分為3組（10只雞胚／組），選擇在雞胚卵黃囊血管區(qū)放置直徑為7 mm無菌濾紙片，分別滴加不同濃度的無菌CIS溶液10 μL（5、10 mg·L－1）和無菌10 μL PBS溶液。每12 h滴加1次，連續(xù)3 d，觀察雞胚新生血管生成情況，并拍照記錄結果。

1．4．4CIS對小鼠移植瘤S180肉瘤抑制實驗 取昆明小鼠48只，實驗分為磷酸鹽緩沖液（PBS）對照組和CIS實驗組1、5、10 mg·kg－1。實驗開始前，每只鼠分別于腋窩皮下接種S180腹水瘤細胞株，4× 106細胞，隨機分4組，每組12只，24 h后分別皮下注射PBS和不同濃度的CIS融合蛋白質(zhì)溶液，每日2次，上、下午各1次，連續(xù)注射7 d。末次給藥結束后，觀察荷瘤鼠腫瘤生長情況，于停藥后d 2處死動物，完整剖取腫瘤組織，并稱量小鼠體重和瘤重，計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率／%＝CIS實驗組瘤體組織重量／PBS對照組瘤體組織重量×100%。實驗組腫瘤抑制率與對照組相比較，用t-test檢驗（Office Excel軟件）進行統(tǒng)計學分析，計算是否具有統(tǒng)計學意義。

1．4．5CIS對小鼠移植瘤Lewis肺癌生長抑制實驗在超凈臺內(nèi)取2只Lewis肺癌C57BL荷瘤小鼠，脫頸椎處死，無菌條件下取瘤組織，用生理鹽水制成勻漿液。另取C57BL 6周齡小鼠30只，于每只小鼠右腋皮下接種勻漿液，每只0.2 mL，含4×106細胞，接種后d 2隨機分成3組：PBS模型對照組和CIS實驗組5、10 mg·kg－1，每組10只。24 h后分別皮下注射PBS和CIS，每日2次，上、下午各1次，連續(xù)注射10 d。末次給藥結束后，觀察荷瘤鼠表現(xiàn)，于停藥后d 2處死動物，完整剖取瘤結并稱瘤重和體重，按上述“1．4．4”中同樣方法計算腫瘤抑制率，并進行統(tǒng)計學分析。

1．4．6CIS對小鼠移植瘤H22肝癌生長抑制實驗在超凈臺內(nèi)抽取H22肝癌荷瘤小鼠腹水，用無菌生理鹽水將收集到的腫瘤細胞濃度調(diào)整為2×1010·L－1。取ICR小鼠30只，右前肢腋皮下接種，每只小鼠0.1 mL，于接種24 h后隨機分為3組：PBS對照組和CIS組5、10 mg·kg－1，每組10只。3 d后分別皮下注射PBS和CIS，每日2次，連續(xù)注射12 d。末次給藥結束后，觀察荷瘤鼠表現(xiàn)，于停藥后d 2處死動物，完整剖取瘤結并稱瘤重和體重，按上述“1.4.4”中同樣方法計算腫瘤抑制率并進行統(tǒng)計學分析。

1．4．7 CIS對人小細胞肺癌H446細胞株裸鼠移植瘤生長抑制實驗 在超凈臺內(nèi)取已在裸鼠體內(nèi)傳代生長良好的人肺癌H446腫瘤結節(jié)，無菌操作制成瘤細胞液，每組6只，共3組。每只小鼠0.1 mL，7 ×109·L－1，接種于裸鼠腋窩皮下。待腫瘤生長至可觸及時（約100 mm3），分別皮下注射基因重組CIS和生理鹽水（模型對照）、陽性貝伐珠單抗（Ava-stin injection，人源化抗人VEGF單克隆抗體注射液，美國羅氏公司產(chǎn)品）。基因重組CIS（5 mg· kg－1），每日2次，上、下午各1次，連續(xù)注射20 d。貝伐珠單抗（5 mg·kg－1）每周注射2次，共注射6次。于實驗開始后，每4日用卡尺測一次皮下腫瘤長徑和短徑體積，末次給藥結束后24 h，處死動物，完整剖取瘤結并稱瘤重和體重，觀察皮下移植瘤的生長情況，按上述“1．4．4”中同樣方法計算腫瘤抑制率，并進行統(tǒng)計學分析。腫瘤體積＝（長徑×短徑2）／2，以時間為橫軸，腫瘤體積為縱軸，繪制腫瘤生長曲線。

1．4．8CIS對人可移植性肝癌SMMC7721細胞株裸鼠移植瘤生長抑制實驗 取已在裸鼠體內(nèi)傳代生長良好人可移植性肝癌SMMC7721細胞腫瘤結節(jié)，無菌操作制成瘤細胞液，接種于裸鼠腋窩皮下，步驟同實驗“1．4．7”。

1．4．9CIS對人胃低分化腺癌BGC823細胞株裸鼠移植瘤生長抑制實驗 取已在裸鼠體內(nèi)傳代生長良好人胃低分化腺癌BGC823細胞腫瘤結節(jié)，無菌操作制成瘤細胞液，接種于裸鼠腋窩皮下，步驟同實驗“1．4．7”。

2　結果

2．1CIS純度檢測 采用12%的SDS-PAGE膠進行電泳，結果顯示，實驗藥品CIS電泳純度為96.7%。

Fig 1 CIS purity detection by SDS-PAGE

2．2CIS對體外培養(yǎng)HUVEC細胞增殖影響 體外MTT實驗結果顯示，與生理鹽水對照組相比，CIS對細胞增殖抑制作用呈劑量依賴關系。48 h，終濃度為1、5、10 mg·L－1時，CIS對HUVEC細胞增殖抑制率分別為49.5%、74.5%和81.1%（Tab 1）。

Tab 1 CIS decreased proliferation rate of HUVEC

2．3CIS對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響 雞胚絨毛尿囊膜實驗結果顯示，與PBS對照組相比（Fig 2A），在覆蓋CIS的雞胚局部，由尿囊膜發(fā)出的新生血管數(shù)量明顯減少或斷裂（Fig 2B、2C），提示CIS融合蛋白具有抑制雞胚新生血管生成作用。

Fig 2 CIS reduced angiogene-sis on chick chorioallantoic membrane

2．4CIS對小鼠S180腹水瘤的抑制作用 實驗結果表明，與PBS對照相比，CIS可明顯抑制S180腹水瘤細胞在小鼠體內(nèi)的生長，腫瘤抑制率為68.6% ～85.3%，呈劑量依賴性，且未見任何明顯的毒副反應（Tab 2）。

Tab 2 Inhibitory effect of CIS on cell growth in mouse S180 ascites sarcoma model

2．5CIS對小鼠Lewis肺癌生長的影響 實驗結果表明，與PBS對照相比，CIS可明顯抑制Lewis肺癌細胞在小鼠體內(nèi)的生長，腫瘤抑制率為81.0%

（CIS 5 mg·kg－1）和87%（CIS 10 mg·kg－1），且未見明顯的毒副反應（Tab 3）。顯微鏡下觀察結果與S180腹水瘤實驗相似，基因重組CIS注射組腫瘤顏色蒼白，毛細血管稀少，很少出血，壞死多。

Tab 3 Inhibitory effect of CIS on tumor cells’growth in Lewis L．C．mouse model

2．6CIS對小鼠H22肝癌生長的影響 實驗結果表明，與PBS對照相比，CIS可明顯抑制H22肝癌細胞在小鼠體內(nèi)的生長，腫瘤抑制率分別為76.9% （CIS 5 mg·kg－1）和84.2%（CIS 10 mg·kg－1），且未見明顯的毒副反應（Tab 4）。顯微鏡下觀察結果與S180腹水瘤實驗相似，基因重組CIS注射組腫瘤顏色蒼白，毛細血管稀少，很少出血，壞死多。

Tab 4 Inhibitory effect of CIS on tumor cell growth in H22 hepatoma mouse model

2．7CIS對人小細胞肺癌H446細胞株裸鼠移植瘤生長的影響 實驗結果表明，與對照相比，基因重組CIS可明顯抑制小細胞肺癌H446細胞在裸鼠體內(nèi)生長，腫瘤抑制率為60.42%，且未見任何毒副反應。陽性藥貝伐珠單抗的抑制率為61.51%（Tab 5）。腫瘤生長曲線顯示（Fig 3），CIS給藥組體內(nèi)腫瘤細胞生長明顯減緩，其生長速度與貝伐珠單抗處理組相近，說明基因重組CIS的抑瘤效果與貝伐珠單抗的作用相近似。

Tab 5 Inhibition of CIS on transplanted small cell lung cancer cells growth in H446 for nude mice model

Fig 3 Tumor volume after administration of CIS on nude mice bearing H446 tumors

2．8CIS對人可移植性肝癌SMMC7721細胞株裸鼠移植瘤生長影響 實驗結果表明，與對照組比較，基因重組CIS可明顯抑制可移植性肝癌SMMC7721細胞在裸鼠體內(nèi)生長，腫瘤抑制率為61.62%，且未見任何明顯毒副反應。陽性藥貝伐珠單抗的抑瘤率為63.37%（Tab 6、Fig 4），結果表明基因重組CIS具有與貝伐珠單抗相近似的抑瘤效果。

Tab 6 Inhibition of CIS on transplanted human hepatoma SMMC7721 cells in nude mice model

Fig 4 Tumor volume after administration of CIS on nude mice bearing SMMC7721 tumors

2．9CIS對人胃低分化腺癌BGC823細胞株裸鼠移植瘤生長影響 結果表明，與對照相比，基因重組

CIS可明顯抑制胃低分化腺癌BGC823細胞在裸鼠體內(nèi)生長，腫瘤抑制率為41.83%，且未見任何毒副反應。陽性藥貝伐珠單抗的腫瘤抑制率為47.83% （Tab 7、Fig 5），結果表明基因重組CIS的抑瘤效果與貝伐珠單抗作用相近似。

Tab 7 Inhibition of CIS on transplanted human hepatoma BGC823 cells in nude mice

Fig 5 Tumor volume after administration of CIS on nude mice bearing BGC823 tumors

3　討論

腫瘤血管生成抑制劑是當今抗腫瘤新藥研究最活躍的領域之一。目前，已有數(shù)十種腫瘤血管生成抑制劑處于研發(fā)的不同階段，有抑制基底膜降解藥物、直接抑制內(nèi)皮細胞增殖藥物、抑制血管生成刺激因子藥物、抑制內(nèi)皮細胞特異性整合素／生存信號藥物、其它藥物有如碳氧氨咪唑等。多個研究小組報道［10－11］，重組的人骨骼肌TnI和鯊魚軟骨提取的TnI具有抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的增生、腫瘤細胞的凋亡、抑制B16小鼠惡性黑素瘤細胞的肺轉、抑制胰腺癌細胞CAPAN-1的肝轉移等作用，且這些作用與其抑制新生血管生成有關［2－4］。我們對心肌TnI的抗腫瘤作用進行了研究，表明重組人心肌TnI也具有抗腫瘤作用（未發(fā)表資料），但重組的人TnI在血液中半衰期短是其不足。我們利用基因工程技術，制備了以人心肌TnI與人工短肽的融合蛋白－CIS，進行體外表達，純化，再進行藥效學初篩，然后選擇出高活性的融合蛋白CIS，在體外高效表達，發(fā)酵，純化，獲得了高純度在血液中穩(wěn)定性較高的基因重組人心肌肌鈣蛋白融合蛋白（CIS）。我們的體內(nèi)實驗證實了CIS對小鼠S180腹水瘤、小鼠Lewis肺癌、小鼠H22肝癌、人小細胞肺癌H446細胞株裸鼠移植瘤、人可移植性肝癌SMMC7721細胞株裸鼠移植瘤、人胃低分化腺癌BGC823細胞株裸鼠移植瘤均有明顯的抑制作用，說明基因重組CIS具有與人骨骼肌TnI和鯊魚軟骨中提取的TnI相似的腫瘤抑制作用。體外實驗證實了CIS可明顯抑制HUVEC細胞的增殖和雞胚絨毛尿囊膜新血管的生成，同時體內(nèi)實驗也發(fā)現(xiàn)，CIS給藥組瘤組織具有腫瘤組織毛細血管稀少、很少出血、壞死多等血管生成抑制表象。這些實驗結果說明重組CIS的抗腫瘤作用與其腫瘤血管生成抑制作用有關。我們的實驗同時采用已上市的腫瘤血管生成抑制劑貝伐單抗作為陽性對照藥物，進行了其抑瘤作用效果的比較，實驗結果表明，CIS抑制腫瘤生長的效果與貝伐單抗相近。因而，我們揭示了一個全新的以心肌TnI全序列為母板，與人工短肽融合形成的新的融合蛋白CIS具有明顯的抗腫瘤作用，且其作用很可能是通過對血管內(nèi)皮細胞的生長抑制而影響新生血管生成的機制來完成的。這為進一步研究CIS融合蛋白的抗腫瘤應用奠定了基礎。

參考文獻：

［1］ Moses M A，Wiederschain D，Wu I，et al．Troponin I is present in human cartilage and inhibits angiogenesis［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（6）：2645－50．

［2］ Feldman L，Rouleau C．Troponin I inhibits capillary endothelial cell proliferation by interaction with the cell＇s bFGF receptor［J］．Microvasc Res，2002，63（1）：41－9．

［3］ Kern B E，Iv J H B，Antoniu B A，et al．Troponin I peptide （Glu94-Leu123），a cartilage-derived angiogenesis inhibitor：in vitro and in vivo effects on human endothelial cells and on pancre-atic cancer［J］．J Gastrointest Surg，2003，7（8）：961－9．

［4］ Schmidt K，Hoffend J A，Kiessling F，et al．Troponin I overex-pression inhibits tumor growth，perfusion，and vascularization of morris hepatoma［J］．J Nuclear Med，2006，47（9）：1506－14．

［5］ Xie Q，Yao S，Chen X，et al．A polypeptide from shark troponin I can inhibit angiogenesis and tumor growth［J］．Mol Biol Rep，2012，39（2）：1493－501．

［6］ Langer R，Brem H，F(xiàn)alterman K，et al．Isolations of a cartilage factor that inhibits tumor neovascularization［J］．Science，1976，193（4247）：70－2．

［7］ Oikawa T，Ashino-Fuse H，Shimamura M，et al．A novel angio-genic inhibitor derived from Japanese shark cartilage（I）．Extrac-tion and estimation of inhibitory activities toward tumor and embry-

onic angiogenesis［J］．Cancer Lett，1990，51（3）：181－6．

［8］ Béliveau R，Gingras D，Kruger E A，et al．The antiangiogenic a-gent neovastat（AE-941）inhibits vascular endothelial growth fac-tor-mediated biological effects［J］．Clin Cancer Res，2002，8（4）：1242－50．

［9］ 劉先俊，周輝云，鄧顯鋒．人骨骼肌肌鈣蛋白C在大腸桿菌中的表達及其抗腫瘤作用［J］．中國生物化學與分子生物學報，2005，21（5）：586－90．

◇消 息◇

［9］ Liu X J，Zhou H Y，Deng X F．Human ThC expressed in E．coli and its effect on anti-tumor［J］．Chin J Biochem Mol Biol，2005，21（5）：586－90．

［10］Ara M，Hyodo M，Ohga N，et al．Identification and expression of troponin T，a new marker on the surface of cultured tumor endo-thelial cells by aptamer ligand［J］．Cancer Med，2014，3（4）：825－34．

［11］Chen C，Liu J B，Bian Z P，et al．Cardiac troponin I is abnormal-ly expressed in non-small cell lung cancer tissues and human canc-er cells［J］．Int J Clin Exp Pathol，2014，7（4）：1314－24．

Inhibitory effect of tumor growth of recombinant protein fused with cardiac troponin I and artificial peptide

LEI Guang-qiang1，LIU Zhao-yang2，JIANG Yi-na3，LI Jin-ping4，CAO Qin-yan1，LI Tao5，LIU Feng-ming1
（1．Guangxi Medical Botanical Institute，Nanning 530024，China；2．Cancer Institute and Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100021，China；3．School of Pharmacy，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China；4．School of Pharmaceutical Engineering＆Life Science，Changzhou University，Changzhou Jiangsu 213016，China；5．Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100050，China）

Abstract：Aim To examine the inhibitory effect of re-combinant cardiac troponin fusion protein composed of subunit I and artificial peptide which was called CIS on tumor growth．Methods The CIS’s effect on the growth of human umbilical vein endothelial cells（HU-VEC）was examined using MTT assay in vitro．Chick chorioallantoic membrane model was applied to study the alteration of angiogenesis treated with purified re-combinant CIS protein．The effect of tumor growth trea-ted with CIS was observed using several in vivo mice xenograft models．Results There was a statistically significant reduction in HUVEC cell proliferative rate when the cells were treated with purified CIS fusion protein，which was also shown in a dose-dependent manner．A decreased amount of new blood vessel for-mation（angiogenesis）on chick embryo chorioallantoic membranes was observed in recombinant CIS protein treated group compared to the untreated control group． A significant inhibition of tumor growth rate was a-chieved in CIS treated mice compared to CIS untreated control mice in 6 different mouse xenograft models．Conclusions The fusion protein CIS shows the inhibi-tory effect on the tumor growth in our in vivo mouse models，and such inhibition could be mediated by the mechanism of CIS’s effect on the decrease of HUVEC cell proliferation and further the reduction of angiogen-esis in tumor tissues．This work could provide the foundation for the in-depth investigations on the phar-maceutical application of CIS targeting anti-tumor ther-apy．

Key words：recombinant fusion protein of myocardial troponin I（CIS）；human umbilical vein endothelial cell（HUVEC）；chick chorioallantoic membrane （CAM）；xenograft tumor；inhibition of tumor growth；anti-angiogenesis；nude mice

作者簡介：雷光強（1978－），男，助理研究員，研究方向：生物制藥，E-mail：44277288＠qq．com；劉鳳鳴（1959－），男，博士，教授，研究方向：腫瘤分子生物學、基因工程藥物，通訊作者，E-mail：mfliu1986＠yahoo．com

基金項目：廣西科學研究與技術開發(fā)計劃（No桂科攻14124004-2-14）

收稿日期：2015－07－09，修回日期：2015－08－16

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）11－1580－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．020