延胡索乙素對小鼠坐骨神經CCI模型背根神經節Cav1．2表達的影響

姜海波，王 軍，蘇建華，房銘銘，楊 楠，楊家偉，萬 芬，肖 杭，唐金榮

（1．南京醫科大學第一附屬醫院神經內科，江蘇南京 210029；2．南京醫科大學公共衛生學院神經毒理系，江蘇南京 211100；3．江蘇大學附屬金壇市人民醫院神經內科，江蘇金壇 213200；4．江蘇省中西醫結合醫院神經內科，江蘇南京 210028）

延胡索乙素對小鼠坐骨神經CCI模型背根神經節Cav1．2表達的影響

姜海波1，王 軍2，蘇建華3，房銘銘4，楊 楠1，楊家偉1，萬 芬1，肖 杭2，唐金榮1

（1．南京醫科大學第一附屬醫院神經內科，江蘇南京 210029；2．南京醫科大學公共衛生學院神經毒理系，江蘇南京 211100；3．江蘇大學附屬金壇市人民醫院神經內科，江蘇金壇 213200；4．江蘇省中西醫結合醫院神經內科，江蘇南京 210028）

中國圖書分類號：R-332；R284．1；R322．85；R441．1；R745．022

摘要：目的 探討延胡索乙素對小鼠坐骨神經慢性壓迫性損傷（CCI）所致神經病理性疼痛的鎮痛作用以及對背根神經節Cav1．2表達的影響。方法 ♂C57BL／6小鼠40只，隨機分為5組，分別為假手術組（S組）、CCI組（C組）、延胡索乙素組（L組）。建立穩定的小鼠坐骨神經慢性壓迫性損傷致神經病理性疼痛模型。按照神經病理性疼痛的誘發和持續時間，又將L組分為誘導期組、誘導維持期組、長程低劑量組。誘導期組于疼痛誘導期（0～5 d）、誘導維持期組于疼痛誘導期及維持期（0～5 d、14～19 d）腹腔給予延胡索乙素45 mg·kg－1，每日1次；長程低劑量組從術后即刻開始腹腔給予延胡索乙素15 mg·kg－1，每日1次，給予19 d。監測小鼠行為學變化，檢測小鼠機械痛閾和熱痛閾，Western blot及免疫組織化學方法測定背根神經節中Cav1．2表達。結果 脊髓背根神經節Cav1．2在C組表達水平最低，S組表達水平最高，在誘導期組、誘導維持期組及長程低劑量組表達明顯上調，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。與C組比較，誘導期組、誘導維持期組高劑量以及長程低劑量組長程低劑量給予延胡索乙素可以明顯緩解神經病理性疼痛誘導的機械痛敏和熱痛敏（P＜0.05，P＜0.01）。高劑量延胡索乙素可以緩解誘導期、維持期的機械痛敏及維持期的熱痛敏（P＜0.05），低劑量延胡索乙素對誘導期機械痛敏和熱痛敏均無明顯作用（P＞0.05）。結論 小鼠CCI模型疼痛的誘導期、誘導維持期應用高劑量以及長程應用低劑量延胡索乙素可明顯緩解坐骨神經慢性壓迫性損傷所致神經病理性疼痛，其可能機制之一是延胡索乙素通過上調脊髓背根經節Cav1．2亞基的表達來發揮鎮痛作用。

關鍵詞：延胡索乙素；Cav1．2；坐骨神經慢性壓迫性損傷；神經病理性疼痛；背根神經節；小鼠

網絡出版時間：2015－10－16 9：52 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．046．html

延胡索乙素（tetrahydropalmatine，THP）是中藥延胡索的主要活性成分，研究證實它可緩解頭痛、胸痛、關節痛以及外傷導致的疼痛［1］，但對于延胡索乙素治療神經病理性疼痛則鮮有報道［2－3］，涉及到的機制包括延胡索乙素激活多巴胺D1受體以及抑制脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）水平。然而，延胡索乙素是否通過調節Cav1．2水平來緩解神經病理性疼痛，目前尚未見報道。近年來研究發現電壓門控鈣通道（voltage-gated calcium channels，VGCC）與神經病理性疼痛密切相關，L型VGCC，尤其是Cav1．2亞基參與了神經病理性疼痛的發生發展［4－5］。另外有研究發現，在豚鼠單個心肌細胞中，延胡索乙素可有效阻滯L型鈣電流［6－7］，表明延胡索乙素和L型VGCC密切相關。延胡索乙素是否通過影響L型VGCC Cav1.2亞基來緩解神經病理性疼痛是本實驗研究的主要任務。

本實驗主要通過觀察坐骨神經慢性壓迫性損傷模型（chronic constriction injury，CCI）下，延胡索乙素對小鼠背根神經節（dorsal root ganglia，DRG）Cav1.2表達的影響，探討延胡索乙素對小鼠神經病理性疼痛的影響及其可能的機制。

1　材料與方法

1．1動物分組 ♂C57BL／6小鼠，清潔級，40只，7 ～8周齡，體質量22～27 g，由南京大學模式動物中心提供（批號：J000664）。將小鼠隨機分為5組：假手術組（S組）、坐骨神經結扎組（C組）、延胡索乙素組（L組）。按照神經病理性疼痛誘發和持續的時間，又將L組分為誘導期組（induction）、誘導維持期組（induction with maintenance）、長程低劑量組（long-term low-dose）。S組小鼠分離坐骨神經但不結扎，C組和L組建立CCI模型。

1．2實驗材料 左旋延胡索乙素（dl-THP）

（A007452，上海將來實業股份有限公司），兔抗Cav1．2抗體（ACC-003，以色列Alomone公司），正常兔血清（AR1010，Boster公司），免疫組化試劑盒DAB顯色液（K5007，丹麥DAKO公司），Von Frey（美國Stoelting公司），冷熱測痛儀（YIS-21A，濟南益延科技發展有限公司）。

1．3CCI模型的建立 按照Bennett等［8］所述的方法制備小鼠CCI模型。用1%戊巴比妥（10 mg· kg－1，ip）麻醉小鼠并固定于手術臺上，剪毛消毒后切開小鼠右下肢股中部皮膚，鈍性分離肌肉暴露坐骨神經，在接近其分叉處用4-0絲線結扎3道，間隔約1 mm，結扎強度以引起小腿肌肉輕度顫動、減慢，但不阻斷通過表層血管的循環為宜。生理鹽水沖洗創面，逐層縫合切口，左側作為自身對照，術畢分籠，常規飼養。

1．4給藥方法 參考Choi等［9］和徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學》［10］以及預實驗結果，確定給藥方法及給藥劑量。誘導期組于疼痛誘導期（0～5 d）、誘導維持期組于疼痛誘導期及維持期（0～5 d、14～19 d）給予延胡索乙素（45 mg·kg－1，ip），每日1次；長程低劑量組從術后即刻開始至實驗終止給予延胡索乙素（15 mg·kg－1，ip），每日1次。

1．5測定小鼠機械痛閾和熱痛閾 各組小鼠分別于術前1 d，術后5、14、19 d測定機械痛閾和熱痛閾。機械痛閾用機械刺激回縮閾（MWT）表示，熱痛閾用熱刺激縮足反應潛伏期（PWL）表示。

1．5．1機械痛閾測定 測定前，將小鼠放入一置于金屬篩網上的19×15×12（cm3）塑料箱內適應15 min，測定時用Von Frey垂直刺激小鼠右足底中部皮膚，以強度漸升的順序進行刺激，纖維絲的壓力值依次為0.07、0.16、0.4、0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0 g。刺激持續時間≤4秒，每個時間點重復5次，每次間隔時間5 min，小鼠出現抬足或舔足行為為陽性反應，如超過10.0 g仍未出現機械刺激引起的陽性反應，則記為10.0 g。5次重復實驗中有3次出現上述反應，則認為該點為機械刺激回縮閾（mechanical withdrawal threshold，MWT）［11］。

1．5．2熱痛閾的測定 將冷熱測痛儀預熱在（55 ±0.3）℃范圍，將小鼠置于熱板上，以出現抬足或舔足行為為陽性反應，此時測痛儀上的值為熱刺激縮足反應潛伏期（thermal paw withdrawal latency，PWL）。刺激持續時間不超過30 s，每次間隔時間15 min，重復3次，取其平均值［12］。

1．6組織取材及固定 小鼠于術后d 19給藥2 h后，以（10 mg·kg－1，ip）水合氯醛麻醉致死。沿背部正中線剪開背部皮膚，剪斷與脊柱相連的肋骨，取出腰段脊柱。沿椎管將脊柱剪成兩半，挑出同側L4 －6脊髓節段背根神經節。每組隨機選取5只小鼠背根神經節放入－80℃冰箱，用于Western blot分析，3只小鼠取背根神經節用4%多聚甲醛固定12 h，常規石蠟包埋，制成厚5 μm石蠟切片，用于免疫組織化學染色。

1．7Western blot檢測Cav1．2蛋白的表達 取背根神經節，加入RIPA裂解液和cocktail蛋白酶抑制劑的混合液（體積比500∶1），超聲勻漿后低溫高速離心（5℃，12 000 r·min－1，15 min），取上清液，BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。取20 μg蛋白上樣電泳（8%分離膠，5%濃縮膠），電泳（濃縮膠電壓60 V，分離膠電壓90 V）后轉印至PVDF膜（200 mA，3 h），5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Cav1．2一抗（1 ∶200）或β-actin（1∶5 000），4℃冰箱孵育過夜。次日洗膜，加入二抗（1∶50 000），室溫孵育2 h。采用ECL化學發光法顯色曝光。

1．8免疫組織化學檢測Cav1．2的表達及結果判定 采用即用型Envision快速酶免疫組化二步法進行背根神經節Cav1．2檢測。切片常規脫蠟至水后，置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（pH 9.0）的修復盒中，于微波爐內進行抗原修復，自然冷卻后PBS沖洗3次，每次5 min；3%過氧化氫室溫避光孵育25 min，滅活過氧化物酶活性；滴加3%BSA室溫封閉30 min后，滴加適當稀釋的一抗（1∶200），4℃冰箱孵育過夜；PBS沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶HRP標記的二抗，4℃冰箱孵育50 min；PBS洗3次后滴加DAB溶液，顯微鏡控制顯色；蘇木精復染，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化數秒，氨水返藍，自來水沖洗；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照實驗中，用0.01 mol·L－1PBS（pH＝7．4）代替一抗，結果為陰性。每只小鼠隨機選取背根神經節切片3張，在400倍的視野下，每張切片隨機選取2個視野進行觀察，以胞質內出現棕黃色顆粒分布計為陽性細胞。由兩名操作者分別用Image-Pro Plus 6．0圖像分析軟件觀察并計數細胞總數及陽性細胞個數，結果取平均值，計算陽性細胞百分率。

1．9統計學分析 所有數據均用SPSS 19.0軟件完成統計分析，正態分布的資料用±s表示，組間比較用單因素方差分析；非正態分布的數據（機械痛閾、熱痛閾）以中位數（四分位數間距，interquartile range，IQR）表示，組間差異比較采用非參數檢驗。

2　結果

2．1動物模型行為學表現 造模后，C組小鼠出現跛行、舔舐傷口、避免傷側肢體負重、懸足等行為學變化，且機械痛閾和熱痛閾于術后d 5～19均明顯降低。S組無上述變化，L組出現上述輕微表現。

2．2機械痛閾、熱痛閾的變化 各組小鼠術前基礎機械痛閾、熱痛閾差異無顯著性，S組小鼠術前與術后差異無顯著性。與術前比較，C組與L組小鼠機械痛閾、熱痛閾均明顯降低（P＜0.05），且C組術后d 14閾值降至最低，以后逐漸恢復，至術后d 19仍明顯低于術前。與C組比較：L組術后d 5，誘導期組、誘導維持期組機械痛閾明顯增高（P＜0.01），熱痛閾無明顯改變（P＞0.05）；長程低劑量組機械痛閾、熱痛閾均無明顯改變（P＞0.05）。與C組相比較：L組術后d 14，誘導期組、誘導維持期組以及長程低劑量組機械痛閾明顯增高（P＜0.01），誘導期組及誘導維持期組的熱痛閾未見明顯改變（P＞0.05），長程低劑量組熱痛閾明顯增高（P＜0.01）。與C組比較：術后d 19，誘導維持期組（P＜0.01）與長程低劑量組（P＜0.01）機械痛閾、熱痛閾均明顯增高；誘導期組機械痛閾明顯增高（P＜0.05），熱痛閾沒有明顯改變（P＞0.05）；且與誘導期組相比，長程低劑量組機械痛閾、熱痛閾明顯增高，差別具有顯著性（P＜0.01）（Tab 1）。

2．3Western blot免疫印跡 在預期的240 ku、43 ku處檢測出Cav1.2、β-actin相應的蛋白條帶（Fig 1A）。半定量分析發現，Cav1．2在S組表達最高，C組表達最低，在誘導期組（P＜0.05）、誘導維持期組（P＜0.01）給予延胡索乙素45 mg·kg－1以及長程低劑量給予延胡索乙素15 mg·kg－1（P＜0.01）明顯上調了Cav1.2水平（Fig 1B）。

2．4免疫組化背根神經節中Cav1．2的表達變化免疫組化結果顯示，背根神經節中Cav1．2陽性細胞胞質有棕黃色顆粒，少部分胞核、胞膜著色（Fig 2A）。Cav1.2陽性細胞在對照組（32.78%± 16.58%）表達最高，在CCI組（10.29%±6.17%）表達最低。誘導期組（20.09%±9.25%）、誘導維持期組（25.00%±6.20%）以及長程低劑量組（27.79.%±12.23%）Cav1.2陽性細胞表達率明顯高于C組（P＜0.01）（Fig 2B）。

Fig 1 Expression of Cav1．2 in DRG after CCI（±s）

Tab 1 Comparison of MWT，PWL of mice at different time points after CCI［M（Q）］

3　討論

本實驗中，C組和L組小鼠均出現跛行、舔爪、足懸空等疼痛行為學表現，C組小鼠機械痛閾和熱痛閾術后d 5～19均明顯降低，表明小鼠神經病理性疼痛模型制備成功。本實驗Western blot以及免疫組化結果發現，脊髓背根神經節Cav1.2在C組表

達水平最低，S組表達水平最高，在誘導期組、誘導維持期組及長程低劑量組表達明顯上調，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），與行為學檢測結果延胡索乙素可以明顯緩解神經病理性疼痛誘發的機械痛敏和熱痛敏同步，這提示了延胡索乙素可能是通過上調脊髓背根神經節神經元Cav1.2亞基來發揮鎮痛作用的。本實驗發現，高劑量延胡索乙素可以緩解誘導期、維持期的機械痛敏以及維持期的熱痛敏，低劑量延胡索乙素對誘導期的機械痛敏和熱痛敏均無明顯作用，這與Choi等［9］報道的結果相符。本研究還發現，和誘導期應用高劑量延胡索乙素相比，長程低劑量延胡索乙素可以更有效緩解神經病理性疼痛誘導的機械痛敏和熱痛敏（P＜0.01），且Cav1.2表達水平也明顯高于誘導期應用高劑量延胡索乙素（P＜0.05），提示了長程低劑量應用延胡索乙素優于誘導期應用高劑量延胡索乙素。

Fig 2 Expression of Cav1．2 in dorsal root ganglia in different groups（±s）

延胡索乙素作為鎮痛鎮靜藥與Cav1.2的相互作用機制目前尚不明確。本實驗中，脊髓背根神經節Cav1.2在C組表達水平最低，這與Kim等［13］的報道一致。Kim等認為，損傷的背根神經節神經元Cav1.2表達下調的原因可能與周圍神經損傷后，背根神經節神經元細胞體的神經肽Y（NPY）增加以及背根神經節神經元交感芽生所致的去甲腎上腺素的釋放有關。而有研究［14－15］發現，延胡索乙素可作為單胺耗竭劑降低中樞及外周組織去甲腎上腺素濃度。此外，延胡索在緩解創傷性應激引起的焦慮和抑郁的同時，抑制了下丘腦NPY的降低［16］。因此，可以推斷延胡索乙素與去甲腎上腺素及NPY有密切關系。延胡索乙素可能通過與NPY相互作用或者通過與NPY及去甲腎上腺素共同作用，調節Cav1.2的表達來緩解神經病理性疼痛。

本實驗首次探究了延胡索乙素可以通過上調L型電壓門控鈣通道Cav1.2亞基的水平來發揮鎮痛作用，為延胡索乙素臨床治療神經病理性疼痛提出了一個新的可能機制。同時，根據神經病理性疼痛的發生及維持情況，通過設置不同的組別來探討延胡索乙素治療神經病理性疼痛的可能最佳方式，為應用延胡索乙素治療神經病理性疼痛提供了臨床參考。

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Effect of tetrahydropalmatine on expression of Cav1.2 in dorsal root ganglion neurons in mice with sciatic nerve chronic constriction injury

JIANG Hai-bo1，WANG Jun2，SU Jian-hua3，FANG Ming-ming4，YANG Nan1，YANG Jia-wei1，WAN Fen1，XIAO Hang2，TANG Jin-rong1
（1．Dept of Neurology，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China；2．Dept of Neurotoxicology，Nanjing Medical University，Nanjing 211100，China；3．Dept of Neurology，the Affiliated Jintan Hospital of Medical College of Jiangsu University，Jintan Jiangsu 213200，China；4．Dept of Neurology，Jiangsu Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine，Nanjing 210028，China）

Abstract：Aim To investigate the analgesic effect of tetrahydropalmatine on Cav1．2 expression in the dorsal root ganglion（DRG）of mice with sciatic nerve chronic constriction injury（CCI）-induced neuropathic pain．Methods Forty male C57BL／6 mice were randomly divided into 5 groups（n＝5）：sham group（group S），CCI group（group C）and L-THP group（group L）．Steady mice models of neuropathic pain were es-tablished by inducing CCI of sciatic nerve．According to development of neuropathic pain in mice，L group was divided into induction period，induction with ma-intenance period and long-term low-dose group．The mice were intraperitoneally administered with 45 mg· kg－1tetrahydropalmatine in induction（day 0～5），in-duction with maintenance（day 0～5，14～19）period of neuropathic pain state．From the instant after opera-tion，15 mg·kg－1tetrahydropalmatine was injected into the long-term low-dose group once per day for 19 days．Then，the behavior changes of mice were moni-tored．Moreover，the threshold of mechanical and ther-mal stimuli was tested．In addition，the expression of Cav1．2 protein was detected by Western blot and im-munohistochemical staining．Results The lowest ex-pression of Cav1．2 was observed in group C and the highest expression level of Cav1．2 was found in group S．Cav1.2 expression was significantly up-regulated in induction period group，induction with maintenance period group and long-term low-dose group（P＜0.05，P＜0.01）．Compared with group C，high dose of tet-rahydropalmatine in induction period group，induction

with maintenance period group and long-term low-dose group showed reduced mechanical allodynia and ther-mal hyperalgesia induced by nerve injury（P＜0.05，P＜0.01）．Meanwhile，high dose of tetrahydropalma-tine significantly relieved the mechanical allodynia in induction period group，induction with maintenance period group and thermal hyperalgesia in maintenance period group（P＜0.05）．However，there was no ob-vious effect on mechanical allodynia and thermal hyper-algesia induced by nerve injury（P＞0.05）in long-term low-dose group．Conclusions High dose of tet- rahydropalmatine in induction period group，induction with maintenance period group and low-dose among the whole experiment process obviously relieves the neuro-pathic pain induced by nerve injury．The analgesic effect of tetrahydropalmatine on neuropathic pain may be due to the increased expression of Cav1．2 protein in DRG neurons．

Key words：tetrahydropalmatine；Cav1.2；sciatic nerve chronic constriction injury；neuropathic pain；dorsal root ganglion；mice

作者簡介：姜海波（1984－），女，碩士，研究方向：周圍神經病，E-mail：jianghaibo30＠126．com；唐金榮（1964－），男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：周圍神經病，通訊作者，E-mail：zdgaoyang＠medmail．com．cn

基金項目：江蘇省自然科學基金資助項目（No BK 2001116）；江蘇省常州市衛生局項目（No 2004-182-01）

收稿日期：2015－07－31，修回日期：2015－09－07

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）11－1598－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．023