HIF-1α、ROCK-2、FoxM1在醋酸鉛誘導PC12細胞損傷中的表達變化

李永金，張 誼，楊開勇，席 可，李少邱，朱春雪，陳月芳，黃曉佳

（江蘇大學醫學院藥理學教研室，江蘇鎮江 212013）

HIF-1α、ROCK-2、FoxM1在醋酸鉛誘導PC12細胞損傷中的表達變化

李永金，張 誼，楊開勇，席 可，李少邱，朱春雪，陳月芳，黃曉佳

（江蘇大學醫學院藥理學教研室，江蘇鎮江 212013）

中國圖書分類號：R-332；R329．24；R916．3；R977．3；R977.6；R995

摘要：目的 探討低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、Rho關聯卷曲螺旋蛋白激酶-2（Rho associated coiled coil forming protein kinase-2，ROCK-2）、叉頭蛋白M1 （forkhead box protein M1，FoxM1）在醋酸鉛［Pb（Ac）2］誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞損傷中的表達和意義。方法 將PC12細胞暴露于不同濃度的Pb（Ac）2（100、200、400 μmol·L－1）24 h以誘導細胞發生損傷。采用噻唑藍比色法檢測細胞的存活率，倒置顯微鏡觀察細胞形態的變化，乳酸脫氫酶漏出率檢測法測定細胞損傷程度，采用試劑盒檢測丙二醛（malondialdehvde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平，Hoechst 33342單熒光染色法觀察細胞凋亡，免疫印跡法檢測細胞HIF-1α、ROCK-2、FoxM1、淋巴瘤／白血病-2（B cell lymphoma／leukemia，Bcl-2）和Bcl-2相關蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）的表達。結果 MTT實驗顯示Pb（Ac）2對PC12細胞具有明顯抑制作用并呈劑量依賴性，與對照組相比，Pb（Ac）2可增加細胞內LDH漏出率，升高MDA含量，降低SOD含量，誘導細胞發生凋亡。此外，Pb（Ac）2上調細胞HIF-1α、ROCK-2的表達，下調FoxM1的表達，提高Bax／Bcl-2的表達比例。結論 Pb（Ac）2誘導PC12細胞發生凋亡可能與HIF-1α、ROCK-2、FoxM1的表達以及自由基損傷有關。

關鍵詞：醋酸鉛；PC12細胞；細胞損傷；HIF-1α；ROCK-2；FoxM1

網絡出版時間：2015－10－16 9：52 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．034．html

鉛是一種普遍存在的工業毒物和環境污染物，長期低劑量接觸鉛對機體的各個系統都有不良影響，尤其是神經系統。鉛對中樞和外周神經系統都有直接毒害作用，對胎兒和兒童影響最大，可造成兒童智力、記憶力和神經行為障礙［1］。目前對鉛的神經毒性機制研究較多，但關于鉛造成神經損傷的機制及可能的藥物保護作用靶點仍需研究。因此，深入研究鉛如何引起神經系統損傷，對于鉛神經毒性的防護和治療有著重要意義。

在神經細胞損傷過程中，有多種因子參與了細胞的死亡過程，其中低氧誘導因子-1（hypoxia-induc-ible factor-1，HIF-1）和Rho關聯卷曲螺旋蛋白激酶（Rho associated coiled coil forming protein kinase，ROCK）受到了廣泛的關注。HIF-1是細胞在缺氧條件下活化的重要轉錄因子，可調控RhoA和ROCK等蛋白的表達變化，尤其是ROCK-2［2］。在缺氧誘導脊髓神經細胞凋亡過程中，HIF-1α、ROCK-2、caspase-3表達上調［3］，提示HIF-1α、ROCK-2參與了神經細胞的損傷過程。但目前仍不明確HIF-1α、ROCK-2是否參與調節鉛誘導的神經細胞損傷。

叉頭蛋白M1（forkhead box protein M1，FoxM1）屬于FOX家族的轉錄因子之一［4］，FoxM1在細胞周期的調節中起著重要作用，在細胞周期的各個時期

均有表達。FoxM1的缺失可導致有絲分裂紡錘體的形成缺陷、細胞分裂延遲，從而導致細胞有絲分裂受阻［5］。同時，FoxM1與細胞的增殖和凋亡也有關，在上皮和間質等高增殖細胞中，FoxM1呈高表達［6］；在非洲爪蟾神經外胚層細胞的增殖中，FoxM1也起到了重要作用［7］。而鹽屋霉素A和硫鏈絲菌肽等作為FoxM1的抑制劑能特異性拮抗FoxM1，從而達到促進細胞凋亡的作用［8］。但目前關于FoxM1在神經細胞損傷方面的研究較少。本實驗選用大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞作為實驗對象，用不同濃度的醋酸鉛［Pb（Ac）2］誘導損傷，探討HIF-1α、ROCK-2、FoxM1在Pb（Ac）2誘導PC12細胞損傷中的作用，為研究鉛神經毒性作用機制提供參考，同時為治療鉛中毒提供新思路。

1　材料與方法

1．1材料 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞株來自于中國科學院上海細胞庫；DMEM培養基和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。Pb（Ac）2購自美國Sigma公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）檢測試劑盒均購自海門市碧云天生物技術研究所。噻唑藍［3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT］購自美國Amresco公司；Hoechst 33342購自美國Gibco公司。兔抗B細胞淋巴瘤／白血病-2（B cell lymphoma／leukemia-2，Bcl-2）單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗HIF-1α、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）多克隆抗體購自美國ImmunoWay公司；兔抗ROCK-2、FoxM1多克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體購自上海康城生物有限公司；辣根過氧化物酶或熒光基團標記的二抗均購自北京康為世紀公司；底物化學發光試劑購自美國Millipore公司。其余試劑均為國產分析純。

1．2細胞培養及藥物處理 將PC12細胞用含10%新生牛血清、1×105U·L－1青霉素、100 mg· L－1鏈霉素的高糖DMEM培養基培養，置于含5% CO2和95%空氣的37℃培養箱中，每2天換液1次，待單層細胞生長至80%后傳代培養。實驗用細胞均處于指數生長期。

將細胞按5×107·L－1密度接種于96孔板和24孔板中，培養24 h后加入不同濃度的Pb（Ac）2，使其終濃度分別為100、200、400 μmol·L－1，繼續培養24 h，對照組加入相應體積的DMEM。

1．3細胞存活率檢測 采用MTT還原法檢測細胞存活率。藥物處理結束后，培養板每孔中加入MTT（終濃度為0.5 g·L－1），37℃反應4 h，傾去培養液，每孔加入100 μL DMSO，待完全溶解后，于490 nm處測定各孔吸光度。按公式：細胞增殖抑制率／%＝（1－處理組吸光度／對照組吸光度）× 100%，計算抑制率。

采用LDH漏出率檢測法檢測細胞死亡率，按照LDH試劑盒說明書進行操作，并計算各組胞內LDH的含量。

1．4細胞內SOD、MDA含量檢測 實驗分組同上，采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法測定細胞內SOD和MDA的含量，檢測按試劑盒說明書操作。

1．5細胞形態學檢測 用不同濃度Pb（Ac）2處理PC12細胞后，于普通光學倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照，觀察細胞形態變化。

1．6細胞凋亡檢測 取對數生長期的PC12細胞，以每孔2×104個細胞接種于24孔培養板中，染毒處理后棄去培養液，用PBS洗滌，然后用冰甲醇固定細胞10 min。吸去固定液，加入Hoechst 33342染色液（終濃度為10 mg·L－1），于室溫下反應5 min，經PBS洗滌后，用熒光酶標儀在激發光波長350 nm，發射光波長460 nm檢測24孔培養板中熒光強度，用倒置熒光顯微鏡觀察培養板中細胞的核變化并計算凋亡小體的數量。

1．7細胞HIF-1α、ROCK-2、FoxM1、Bax、Bcl-2蛋白的表達檢測 PC12細胞經不同濃度的Pb（Ac）2處理后，收集細胞，提取總蛋白并測定蛋白濃度。以30 μg總蛋白上樣進行電泳，轉膜封閉后加入抗HIF-1α（1∶1 000）、ROCK-2（1∶1 000）、FoxM1（1 ∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）和GAP-DH（1∶7 000）抗體于4℃反應過夜。洗滌后，將膜和相應二抗（1∶5 000）在室溫下反應1 h，以底物化學發光試劑顯色后，以凝膠成像系統（Tanon 5200，南京麥高德生物科技公司）進行掃描，以Image J軟件分析各條帶灰度值。以GAPDH條帶灰度值作參照，進行半定量分析。

2　結果

2．1Pb（Ac）2對PC12細胞存活率的影響 實驗

結果表明，PC12細胞經不同濃度的Pb（Ac）2（100、200、400 μmol·L－1）染毒處理24 h，細胞存活率逐漸降低，100 μmol·L－1Pb（Ac）2即可引起細胞出現損傷，如Fig 1A所示。經計算，Pb（Ac）2引起PC12細胞損傷的IC50為（893±60.78）μmol·L－1。此外，如Fig 1B所示，LDH漏出率實驗結果也表明Pb（Ac）2可明顯引起PC12細胞損傷。

Fig 1 Treatment with Pb（Ac）2decreases viability in PC12 cells（±s，n＝5）

Fig 2 Pb（Ac）2decreases SOD activity and increases MDA level in PC12 cells（±s，n＝5）

Fig 3 Morphological changes induced by Pb（Ac）2in PC12 cells

2．2Pb（Ac）2損傷PC12細胞后SOD和MDA的水平變化 本實驗采用比色法檢測了Pb（Ac）2誘導PC12細胞損傷后，細胞內SOD、MDA含量的變化。結果如Fig 2所示，PC12細胞經不同濃度Pb （Ac）2處理24 h后，隨著藥物濃度的逐漸加大，細胞內SOD含量明顯下降，而MDA的含量明顯增加。

2．3Pb（Ac）2對PC12細胞形態的影響 如Fig 3所示，對照組PC12細胞形態完整且飽滿，并且軸突

較長。經100 μmol·L－1Pb（Ac）2損傷24 h后，PC12細胞密度減少并開始出現死亡；而400 μmol·L－1Pb（Ac）2則使細胞的胞體明顯皺縮成圓形，軸突變短變少，導致大量細胞死亡。

2．4Pb（Ac）2對PC12細胞凋亡的影響 熒光染料Hoechst 33342能少許透過正常細胞的細胞膜，產生的藍色熒光也較弱；而凋亡細胞由于膜通透性增強，從而進入細胞膜內的染料比正常細胞多，故熒光強度加強。如Fig 4A所示，經不同濃度的Pb（Ac）2處理細胞24 h后，對照組細胞核呈現均勻彌散熒光，200 μmol·L－1的Pb（Ac）2可導致細胞的細胞核濃縮碎裂，出現凋亡小體，藍色熒光增強；而400 μmol·L－1的Pb（Ac）2則可導致大量細胞出現凋亡，藍色熒光進一步增強，熒光強度和Hoechst陽性細胞數目經統計學分析與對照組相比差異有統計學意義（Fig 4B、C）。

2．5Pb（Ac）2對PC12細胞HIF-1α、ROCK-2、FoxM1、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 Bcl-2家族基因與細胞凋亡關系密切，其中Bcl-2和Bax是一對正負凋亡的調節基因，通過表達的蛋白發揮促進或抑制細胞凋亡的作用［9］。在細胞出現損傷的過程中，可造成Bax／Bcl-2表達比例增高，進而導致細胞凋亡。本實驗通過Western blot的方法檢測了HIF-1α、ROCK-2、FoxM1、Bax、Bcl-2的蛋白表達變化。如Fig 5所示，細胞經不同濃度Pb（Ac）2處理24 h后，HIF-1α和ROCK-2表達明顯上調，而FoxM1表達明顯降低，同時Bax／Bcl-2表達比例明顯升高。

3　討論

長期暴露于鉛，可引起成人神經系統的損傷［10］。在阿爾茨海默病的相關神經病理學的研究中，將猴子和大鼠暴露于低濃度的鉛中，可導致認知功能的下降［11］。目前已知的關于鉛神經毒性機制的研究有很多，如鉛可以誘導氧化應激引起細胞損傷，誘導細胞凋亡，誘導興奮性毒性，損傷血管內皮細胞和中樞神經屏障系統等［12］。本實驗結果顯示，Pb（Ac）2（100～400 μmol·L－1）可劑量依賴性地引起大鼠PC12細胞損傷，導致細胞內氧自由基水平升高，出現凋亡。此外，Pb（Ac）2誘導了PC12細胞HIF-1α、ROCK-2的表達上調、Bax／Bcl-2的表達比例增加，FoxM1的表達下調。提示Pb（Ac）2可通過激活HIF-1α及ROCK-2，進而啟動細胞凋亡程序，導致PC12細胞發生凋亡。

Fig 4 Pb（Ac）2enhances the cell apoptosis in PC12 cells

Pb（Ac）2可激動神經元膜上NMDA受體，導致鈣離子內流使細胞鈣超載，引起細胞損傷［13－14］。同時，鉛可引起活性氧大量釋放，導致神經組織氧化損傷，如Pb（Ac）2可引起大鼠腦組織大量產生活性氧，導致脂質過氧化損傷［15］；而NMDA受體拮抗劑MK-801可減少活性氧產生，起到神經保護作用［16］。

本實驗中，將PC12細胞暴露于不同濃度的Pb（Ac）224 h，存活率明顯降低，LDH漏出率提高，細胞軸突縮短減少，胞體變圓。此外，Pb（Ac）2還能引起細胞內SOD和MDA含量水平的變化。SOD是一種蛋白酶，可清除氧自由基，發揮抗氧化作用，保護細胞免受損傷。當機體抗氧化體系能力降低時，過量氧自由基攻擊生物膜而引發脂質過氧化反應，導致過氧化產物如MDA大量產生。因而SOD活性降低和MDA含量增加均提示氧自由基水平的增加，可間接反映細胞氧化應激的程度，說明細胞損傷可能與細胞內氧自由基水平的增加有關。

Fig 5 Pb（Ac）2increases expressions of HIF-1α，ROCK-2 and Bax／Bcl-2 ratio and decreases expression of FoxM1 in PC12 cells（±s，n＝4）

HIF-1α是機體缺氧適應性反應過程中的一種

極其重要的核轉錄因子，HIF-1α及其介導的信號通路在神經細胞損傷過程中發揮了重要作用。離體培養的大鼠神經元在遭受缺血樣損傷后，HIF-1α表達明顯上調并集中于核內，最終因HIF-1α過表達導致細胞死亡［17］；2-甲氧雌甾二醇作為HIF-1α的抑制劑可發揮保護作用［18］，表明HIF-1α可能參與了神經損傷。在本實驗中，100～400 μmol·L－1Pb（Ac）2作用PC12細胞24 h后，發現細胞內活性氧水平升高，進而導致HIF-1α表達明顯增加，并且呈現出劑量依賴性，表明HIF-1α信號通路可能參與了PC12細胞損傷過程。同時，熒光染色的實驗結果也證實，PC12細胞損傷后表現出形態的縮小，軸突縮短，細胞核皺縮等典型凋亡現象，表明Pb（Ac）2可誘導細胞出現凋亡性死亡。細胞凋亡是一種復雜的生化過程，有許多蛋白質參與了這一過程，包括凋亡前體蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2，Bax／Bcl-2比值成為凋亡的重要生化指標［9］。HIF-1α的激活也可引起Bax／Bcl-2比值上升，進而誘導細胞發生凋亡［19］。與以上結果相一致，本實驗中PC12細胞經Pb（Ac）2處理后Bax／Bcl-2表達比值增加，確認Pb（Ac）2可上調Bax／Bcl-2表達比例，誘導細胞凋亡。

在很多精神異常以及中樞神經系統損傷中，RhoA／ROCK-2通路都會被激活，從而影響細胞骨架的穩定性，抑制生長錐的形成以及軸突的恢復與再生，導致阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病等多種退行性變的發生［20］。ROCK是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，包括ROCK-1和ROCK-2兩種亞型，其中ROCK-2與調整細胞骨架成分運動和基因表達調控有關。神經元軸突損傷后，ROCK表達增加，抑制ROCK的活化有利于神經突的再生以及神經元的上樹突的分化，可保護神經元［21］。在海人藻酸誘導HT22神經細胞的退行性病變中，抑制ROCK-2可穩定神經絲，保護神經元的結構［22］。本實驗的結果表明，Pb（Ac）2濃度200 μmol·L－1時就可引起PC12細胞內ROCK-2蛋白表達明顯上調，推斷ROCK-2的激活參與了鉛神經毒性損傷的調節。

此外，FoxM1在細胞增殖和凋亡中也發揮重要作用。下調FoxM1可抑制乳腺癌細胞的生長、增殖和遷移侵襲［23］；在紫花牡荊素誘導乳腺癌細胞凋亡過程中，FoxM1及下游靶分子生存素表達均下調［24］；下調FoxM1抑制生存素也可誘導宮頸癌細胞凋亡［25］，表明細胞增殖與凋亡的機制可能與FoxM1有關。但FoxM1大多用于腫瘤細胞的研究，神經細胞的研究報道較少。本實驗結果發現，正常組細胞FoxM1高表達，Pb（Ac）2作用PC12細胞24 h后，FoxM1表達明顯降低，表明FoxM1可能正性調節了神經細胞的存活。

綜上所述，本研究證明了Pb（Ac）2可劑量性導致PC12細胞出現損傷，同時誘導HIF-1α、ROCK-2高表達，FoxM1低表達。表明HIF-1α／ROCK-2／FoxM1信號可能參與了該損傷過程。該結果提示，HIF-1α參與了鉛的神經毒性，抑制HIF-1α及其下游信號通路可能具有減輕神經細胞損傷的作用。

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Expression changes of HIF-1α，ROCK-2，FoxM1 in the lead acetate-induced injury in PC12 cells

LI Yong-jin，ZHANG Yi，YANG Kai-yong，XI Ke，LI Shao-qiu，ZHU Chun-xue，CHEN Yue-fang，HUANG Xiao-jia
（Dept of Pharmacology，School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Abstract：Aim To investigate the expression and im-plication of HIF-1α，ROCK-2，FoxM1 in PC12 cell in-jury induced by lead acetate．Methods PC12 cells were treated with lead acetate at the doses of 100，200 and 400 μmol·L－1．The cell viability was determined by MTT reduction assay and LDH assay，the intracellu-lar production of oxygen species was measured by as-sessing SOD and MDA levels，cell apoptosis was deter-mined by Hoechst 33342 staining，the expressions of HIF-1α，ROCK-2，FoxM1，Bcl-2 and Bax were deter-mined by immunoblotting analysis．Results Lead ac- etate induced cell injury in PC12 cells in a dose-de-pendent manner，and it potentiated oxygen radical pro-duction and cell apoptosis．In addition，lead acetate enhanced HIF-1α and ROCK-2 expressions，increased Bax／Bcl-2 ratio and decreased FoxM1 expression．Conclusion Lead acetate can induce PC12 cell apop-tosis，which may be related with the expressions of HIF-1α，ROCK-2 and FoxM1．Cellular oxidative stress may contribute to the injury as well．

Key words：lead acetate；PC12 cells；cell injury；HIF-1α；ROCK-2；FoxM1

作者簡介：李永金（1968－），男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：神經藥理學，E-mail：lyj3600＠163．com；黃曉佳（1980－），男，博士，副教授，研究方向：神經藥理學，通訊作者，Tel：0511-88791201，E-mail：harold1980＠163．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81300059）；江蘇大學高級人才基金項目（No 08JDG005，11JDG092）

收稿日期：2015－07－01，修回日期：2015－08－03

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）11－1562－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．017