甾醇類新藥NSC67657誘導的HL60細胞單核系分化中β-catenin／ICAT蛋白差異表達及相互作用研究

王偉佳，張秀明，胡紅霞

（中山大學附屬中山醫院檢驗醫學中心，廣東省重點實驗室，廣東中山 528403）

甾醇類新藥NSC67657誘導的HL60細胞單核系分化中β-catenin／ICAT蛋白差異表達及相互作用研究

王偉佳，張秀明，胡紅霞

（中山大學附屬中山醫院檢驗醫學中心，廣東省重點實驗室，廣東中山 528403）

中國圖書分類號：R329．2；R329．24；R394．2；R977．6

摘要：目的 分析甾醇類新藥NSC67657誘導HL60細胞單核系分化中，β-catenin／ICAT蛋白的差異表達及相互作用，探討NSC67657誘導細胞分化的作用機制。方法 應用10 μmol·L－1NSC67657誘導HL60細胞分化，采用細胞化學染色和流式細胞技術評估細胞的分化方向和分化程度；通過RT-PCR和Western blot方法驗證藥物作用細胞前后β-cate-nin和ICAT基因和蛋白的表達差異；采用免疫共沉淀技術分析β-catenin與ICAT蛋白的相互作用情況；采用激光共聚焦技術協同分析目的蛋白的差異表達及細胞內定位。結果

NSC67657可誘導HL60細胞向單核系分化。在10 μmol· L－1NSC67657作用5 d后，CD14的表達可達到90%以上，細胞化學染色支持細胞單核系分化結論。分化后ICAT基因和蛋白表達明顯升高（P＜0.01），而β-catenin基因和蛋白表達明顯下降（P＜0.05）。免疫共沉淀結果顯示，ICAT與β-catenin蛋白在細胞分化前后都存在相互作用，藥物誘導細胞分化后兩者蛋白相互作用條帶吸光度明顯增加。激光共聚焦結果顯示，ICAT蛋白和β-catenin蛋白在胞質和胞核均有熒光，藥物誘導HL60細胞分化后，ICAT蛋白胞質和胞核熒光均明顯增加，β-catenin蛋白在核內熒光明顯減弱，但胞質熒光強度增加，有蛋白胞質轉位現象。結論 NSC67657能夠誘導HL60細胞向單核系分化，且引起ICAT蛋白和β-catenin蛋白的表達差異；ICAT蛋白與β-catenin蛋白的相互作用增強及β-catenin蛋白從胞核向胞質的轉位現象，提示NSC67657可能通過下調并阻止β-catenin蛋白入核，從而導致HL60細胞單核系分化。

關鍵詞：NSC67657；分化，單核系；β-catenin／ICAT蛋白；表達差異；相互作用；HL60細胞

網絡出版時間：2015－10－16 9：52 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．028．html

NSC67657是美國癌癥研究中心（National Canc- er Institute，NCI）近期報道的甾醇類新藥，能夠高效促進人急性髓系白血病HL60細胞向單核系分化［1］。前期研究中，課題組采用比較蛋白質組學技術，篩選了細胞分化差異表達蛋白，其中β-catenin相關蛋白1（beta-catenin-interacting protein 1，ICAT）作為Wnt信號通路的關鍵蛋白質分子通過質譜技術得到確認［2］。為了了解Wnt信號通路在細胞分化中的作用，本研究將對細胞分化前后ICAT蛋白及與之相關的β-連環素蛋白（β-catenin）的表達水平、相互作用及細胞內定位進行分析，對Wnt信號通路在藥物誘導HL60單核系分化中的可能作用機制進行探討。

1　材料與方法

1．1細胞系與主要試劑 人髓系白血病細胞系HL60（上海細胞庫生命科學研究所）；甾醇類新藥NSC67657（美國癌癥研究中心）；細胞培養基IM-DM、胎牛血清（美國Gibco公司）；RT-PCR試劑盒（大連寶生物有限公司）；羊抗人ICAT多抗、兔抗人β-catenin多抗、辣根過氧化物酶標記抗羊、抗兔二抗及兔抗人β-tubulin單抗等（美國Santa Cruz公司）；抗CD14及其對照抗體（深圳晶美生物工程有限公司）；DAPI核熒光染料、RBITC標記抗羊二抗、FITC標記抗兔二抗（碧云天生物技術有限公司）；細胞蛋白抽提純化試劑盒（上海生物工程有限公司）。

1．2NSC67657誘導HL60細胞分化驗證 收集對數生長期非藥物處理HL60細胞和10 μmol·L－1的NSC67657作用5 d后的細胞，PBS洗滌3次，調節細胞濃度5×108·L－1，離心涂片，參照教材《血液學檢驗試驗指導》［3］分別對藥物作用前后細胞進行瑞氏染色、酯酶染色及NaF抑制試驗，觀察細胞形態。同樣取對數生長期HL60細胞，加入NSC67657誘導細胞分化，采用流式細胞技術檢測細胞表面分化抗原CD14的表達情況。對照組除未加藥物其余與處理組相同。

1．3NSC67657誘導HL60細胞分化中ICAT與β-catenin基因和蛋白的表達情況 收集對數生長期HL60細胞，調整細胞濃度為1×109·L－1，采用

10μmol·L－1的NSC67657作用HL60細胞，對照組除未加NSC67657外其余與處理組相同。處理組與對照組在37℃、5%CO2條件下培養5 d，提取細胞總RNA，逆轉錄后經過30個循環擴增。產物經0.15 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳，在Bio-Rad凝膠成像儀上觀察并分析光密度。引物設計如下：β-catenin正義5′-CTGCAGGGGTCCTCTGTG-3′，反義5′-TG-CATATGTCGCCACACC-3′；ICAT正義5′-GGGAAT-TCATGAACCGCGAGGGAGCAC-3′，反義5′-GGG-GATCCCAGCTACTGCCTCCG GTCTTCCGTCTC-3′。

同樣收集對照組與處理組細胞，用細胞裂解液裂解，提取總蛋白，Bradford法進行蛋白定量。取60 μg蛋白進行16%SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉膜、封閉、加入抗體孵育。化學發光法顯色，于Bio-Rad凝膠儀上成像并進行密度分析。

1．4采用免疫共沉淀（Co-IP）分析ICAT蛋白與β-catenin蛋白之間的相互作用 收集非處理和NSC67657作用5 d后的HL60細胞，加入細胞裂解液和細胞蛋白酶抑制劑PMSF，待細胞充分裂解后加入8 μg抗β-catenin抗體，4℃緩慢搖晃孵育過夜；取100 μL protein A瓊脂糖珠，將protein A瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中，4℃緩慢搖晃孵育2～4 h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；免疫沉淀反應后，低溫條件離心吸去上清，裂解緩洗滌；最后加入2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min，離心后取上清；采用抗ICAT抗體，依據上述Western blot方法確定結合蛋白。采用結腸癌SW480細胞蛋白做為陽性對照。

1．5激光共聚焦分析藥物作用HL60細胞前后ICAT與β-catenin蛋白的表達與定位 分別收集非處理和NSC67657作用5 d后的HL60細胞，冷丙酮固定30 min，經過150 mL·L－1小牛血清封閉，PBS洗滌后，孵育不同種屬來源一抗，4℃過夜。再次洗滌后，先后滴加RBITC標記和FITC標記且針對不同種屬的二抗和DAPI染料，分別孵育30 min 和3 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1．6統計學分析 結果通過統計軟件SPSS 11.5分析。均值間比較使用t檢驗，藥物處理前后ICAT 與β-catenin表達比較采用配對t檢驗。

2　結果

2．1NSC67657誘導HL60細胞單核系分化驗證HL60細胞在NSC67657作用下增殖明顯受抑，瑞氏染色中，對照組HL-60細胞仍處于幼稚原始狀態，處理組可見明顯的單核系分化的細胞，如Fig 1A、B所示。酯酶染色中，對照組HL60細胞酯酶染色陽性，但不會被NaF抑制，NSC67657處理組NaF抑制率＞50%，如Fig 1C、D所示。對照組CD14＋細胞小于2%，藥物處理組CD14＋細胞大于90%，如Fig 1E、F所示。以上結果提示NSC67657已誘導HL60細胞完全分化。

Fig 1 Verification of HL60 cellular differentiation when induced by NSC67657

2．2NSC67657誘導HL60細胞分化前后ICAT／β-catenin差異表達分析 NSC67657作用HL60細胞5 d后，可見ICAT基因表達增加（P＜0.01），蛋白水平也相應增加（P＜0.01），如Fig 2A、B所示。反之，β-catenin基因表達下調（P＜0.05），蛋白水平也相應下調（P＜0.05），如Fig 2C、D所示。

2．3藥物誘導細胞分化前后ICAT蛋白與β-cate-nin蛋白之間相互作用確認 本實驗采用β-catenin一抗包被瓊脂糖珠，與之結合的ICAT蛋白被順利檢測，非藥物處理組與NSC67657誘導分化組樣本的上清液中均檢測到ICAT蛋白，提示該實驗樣本有ICAT蛋白的表達；Co-IP實驗顯示NSC67657處理

組ICAT蛋白條帶吸光度明顯高于非處理組，不僅驗證了β-catenin／ICAT蛋白存在相互作用，還提示藥物處理后ICAT蛋白與β-catenin蛋白相互作用有增強的趨勢，如Fig 3所示。

Fig 2 Differential expression of ICAT／β-catenin in HL60 cells when treated or not treated by NSC67657

Fig 3 Protein interaction between ICAT and β-catenin in HL60 cells when treated or not treated by NSC67657

2．4激光共聚焦檢測ICAT／β-catenin蛋白在細胞內表達差異及細胞內定位 實驗結果顯示，NSC67657作用HL60細胞后，ICAT蛋白（紅色標記）熒光強度明顯增加，細胞核內及胞質中均現熒光增強趨勢；相比之下，β-catenin蛋白（綠色熒光）熒光強度下降，尤其是細胞核內熒光明顯減弱，而胞質熒光強度增加，呈現熒光胞質轉位現象，提示β-catenin蛋白在藥物作用后可能入核減少，如Fig 4

所示。

Fig 4 Pictures from laser confocal microscopy to analyze the expression and intracellular location ofICAT／β-catenin proteins

3　討論

Wnt信號通路是一個復雜的蛋白質作用網絡，其功能常見于胚胎發育期和癌癥，但也參與成年動物的正常生理。Wnt信號通路是細胞增殖分化的關鍵調節環節，參與了基因表達調節、細胞的遷移黏附、細胞極化等過程，同時還與其他信號通路存在交叉協同，參與干細胞的更新和分化［4］。其經典的激活途徑是游離的β-catenin進入細胞核與輔轉錄因子LEF／TCF結合，調節下游基因如cyclin D1［5］、c-Myc［6］、PPARδ［7］、Tcf-1［8］和CD44［9］等的表達，這些基因的激活在細胞的增殖、分化以及惡性轉變中都發揮重要作用［10］。整個通路存在內在平衡，一旦平衡打破，就可能成為腫瘤發生的重要誘因。ICAT蛋白是Wnt信號通路的重要調節因子，其可以與LEF／ TCF競爭性地結合β-catenin蛋白，從而抑制下游靶點激活［11］。雖然這些假說在其他研究中已經得到證實，但NSC67657是否通過這條通路誘導HL60細胞單核系分化仍需進一步確認。

本研究驗證了HL60細胞單核系分化后ICAT基因和蛋白的表達上調，β-catenin基因和蛋白的表達下調，提示藥物可能通過誘導ICAT的表達升高，從而干預β-catenin與LEF／TCF的結合及下游靶點的激活。免疫共沉淀結果顯示，ICAT蛋白與β-cate-nin蛋白確實在細胞分化前后存在相互作用，且在藥物誘導細胞分化后作用增強，可能與ICAT蛋白高表達有關，但不能解釋β-catenin蛋白低表達的現象。激光共聚焦結果顯示，NSC67657誘導HL60細胞單核系分化后，ICAT蛋白在細胞核和胞質均表達升高，β-catenin蛋白反之下降。有趣的是，β-catenin蛋白不但整體熒光減弱，還出現蛋白向胞質轉位趨勢，這與Rhee等報道結果對應。Rhee等［12］將10株頭頸部鱗狀細胞癌細胞株與正常口腔上皮細胞進行比較，結果顯示Wnt10的水平在前者明顯增加。并且發現19個Wnt家族成員的11個在頭頸部鱗狀細胞癌細胞株中高表達，同時表達Wnt的癌細胞胞質中β-catenin水平增高，并向胞核移位，提示了鱗狀細胞癌細胞的生長和存活與Wnt信號通路的相關性。雖然白血病細胞與頸部鱗狀癌細胞屬于不同種屬，但能為Wnt信號通路在腫瘤發病機制的研究提供借鑒。

本研究首次報道了甾醇類新藥NSC67657誘導HL60細胞分化的可能機制，作為高效誘導劑，其分子機制的深入研究將為后期化療藥物的開發及靶向治療提供理論依據和實驗基礎。該研究僅為Wnt通路對分化作用的初步探討，其下游靶基因的變化趨勢，及ICAT蛋白受到抑制或Wnt信號通路受到激活的情況下，細胞是否仍然會被藥物誘導等一系列問題將是本課題組后續的研究重點。

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Differential expression and interaction of β-catenin／ICAT proteins in NSC67657 induced monocytic differentiation of HL60 cells

WANG Wei-jia，ZHANG Xiu-ming，HU Hong-xia
（Dept of Laboratory Medicine，Key Laboratory of Guangdong Province，Sun Yat-sun University Affiliated Zhongshan Hospital，Zhongshan Guangdong 528403，China）

Abstract：Aim To analyze differential expression and interaction of β-catenin／ICAT proteins in HL60 cells when they were induced into monocytic differentiation，and to figure out the mechanism of NSC67657 in cellu-lar induction．Methods HL60 cells were treated by 10 μmol·L－1NSC67657，and cellular differentiation could be observed by cytochemical staining and flow cytometry．Then，RT-PCR and Western blot were em-ployed to determine the differential expression of β-catenin／ICAT genes and proteins．Co-immunoprecipi-tation assay was used to confirm the interaction of β-catenin／ICAT proteins，and laser co-focus light mi-croscopy technology was used to co-indentify proteins differential expression and intracellular location．Re-sults HL60 cells could be induced into monocytic dif-ferentiation after 5 days treatment using 10μM NSC67657．The CD14（＋）%cells could be up to o-ver 90%，and cytochemical staining reports were con-sistent with this result．The expressions of ICAT gene and protein were up-regulated significantly（P＜ 0.01），but the expressions of β-catenin gene and pro-tein，on the contrary，were down-regulated（P＜0.05）when HL60 cells were induced into monocytic differen-tiation．From co-immunoprecipitation assay findings，ICAT protein interacted with β-catenin protein，and the absorbance of protein electrophoresis bands in-creased in differentiated cells．From laser co-focus light microscopy assay findings，the fluorescence of ICAT and β-catenin protein could be both observed in cytoplasm and nucleus．In drug treated HL60 cells，the fluorescence of ICAT protein was enhanced both in cytoplasm and nucleus，however，the fluorescence ofβ-catenin protein，which looked like transferring into different organelles，decreased significantly in nucleus，but increased in cytoplasm．Conclusions HL60 cells could be induced into monocytic differentiation by NSC67657 and β-catenin／ICAT proteins differentially expressed during cellular differentiation．The enhanced interaction of β-catenin／ICAT proteins and β-catenin protein transferring from nucleus into cytoplasm indi-

cates that NSC67657 probably induces HL60 cells into monocytic differentiation through down-regulating β-catenin protein and blocking β-catenin protein from nu-cleus．

Key words：NSC67657；monocytic differentiation；β-catenin／ICAT proteins；differential expression；inter-action；HL60 cells

作者簡介：王偉佳（1981－），男，博士后，研究方向：白血病化療新藥的開發與應用，E-mail：xuelangchichao＠163．com；張秀明（1964－），男，碩士，教授，研究方向：蛋白質組學技術在新藥開發研究中的應用，通訊作者，E-mail：snow-touching＠hotmail．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81301492）

收稿日期：2015－07－29，修回日期：2015－08－26

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）11－1547－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．014