人參皂苷F1通過激活孕烷X受體誘導(dǎo)CYP3A4的表達(dá)

油文亭，周 濤，馬增春，梁乾德，湯響林，肖成榮，譚洪玲，肖 勇，王宇光，高 月

（1．安徽醫(yī)科大學(xué)研究生院，安徽合肥 230032；2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

人參皂苷F1通過激活孕烷X受體誘導(dǎo)CYP3A4的表達(dá)

油文亭1，周 濤2，馬增春2，梁乾德2，湯響林2，肖成榮2，譚洪玲2，肖 勇2，王宇光2，高 月2

（1．安徽醫(yī)科大學(xué)研究生院，安徽合肥 230032；2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

中國圖書分類號：R284．1；R345．99；R392．11；R394．2；R977．3

摘要：目的 探索人參皂苷F1（ginsenoside F1）是否通過激活孕烷X受體（PXR）實(shí)現(xiàn)對CYP3A4基因表達(dá)及酶活性的誘導(dǎo)作用。方法 利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的PXR-CYP3A4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2工程細(xì)胞株結(jié)合熒光素酶報告基因技術(shù)，檢測人參皂苷F1對PXR的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)；用不同濃度的人參皂苷F1處理LS174T細(xì)胞，并通過Q-PCR和酶活性試劑盒檢測CYP3A4的mRNA表達(dá)和酶活性變化。結(jié)果 不同濃度人參皂苷F1作用于LS174T細(xì)胞以后，可以濃度依賴性地誘導(dǎo)CYP3A4 mRNA水平的表達(dá)，并且增強(qiáng)其酶活性；同時，PXR-CYP3A4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2工程細(xì)胞株結(jié)合熒光素酶報告基因檢測結(jié)果亦表明，人參皂苷F1能夠濃度依賴性地增強(qiáng)PXR的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)。結(jié)論 本研究揭示了人參皂苷F1可誘導(dǎo)CYP3A4的基因表達(dá)并增強(qiáng)其酶活性，這一過程可能與人參皂苷F1對孕烷X受體的激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞：人參皂苷F1；PXR；CYP3A4；熒光實(shí)時定量PCR；mRNA；酶活性

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－10－16 9：52 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．024．html

人參（Panax ginseng C．A．）是常見的補(bǔ)益中藥，具有大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫、生津養(yǎng)血、安神益智之功效，是目前常用的一味臨床中藥。其中人參皂苷是其主要的藥理活性成分，約占人參組成的4%。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，人參皂苷具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力［1］、延緩衰老［2］、改善心腦血管［3］、增強(qiáng)記憶力［4］、抑制腫瘤細(xì)胞生長［5］等作用，臨床用藥時常與其他西藥聯(lián)合使用。多種藥物同時服用時，常會由于彼此之間的相互影響而產(chǎn)生不可預(yù)期的藥物不良反應(yīng)。藥物之間的相互作用與多種因素有關(guān)，其中以藥物代謝酶即細(xì)胞色素P450（cytochrome P450）與藥物相互作用的關(guān)系最為密切［6］。CYP3A作為P450家族中最重要的I相藥物代謝酶系統(tǒng)，參與超過50%的臨床藥物的代謝［7］。研究已證明孕烷X受體（PXR）是調(diào)控CYP3A4基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，許多藥物對PXR活性都有潛在的激動效應(yīng)，從而誘導(dǎo)CYP3A的表達(dá)，導(dǎo)致其與CYP3A底物類藥物聯(lián)合使用時影響其代謝而致藥物不良反應(yīng)的發(fā)生［8－9］。

目前，針對人參皂苷對于藥物代謝酶影響的研究還較少。本實(shí)驗(yàn)室前期工作建立了基于分泌型Gaussia熒光素酶報告基因pGLuc-Basic系統(tǒng)，將報告基因載體和人PXR表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞［10］，并利用該模型篩選了人參中主要皂苷類成分對PXR活性的激動效應(yīng)，初步研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷F1有明顯激活PXR活性的作用。于是本研究進(jìn)一步探索了人參皂苷F1對LS174T細(xì)胞中CYP3A4 mRNA表達(dá)及酶活性的影響，以確證其是否通過激活PXR，從而誘導(dǎo)了CYP3A4的基因表達(dá)及酶活性，將有助于提示人參皂苷F1與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用時會產(chǎn)生的藥物相互作用，為人參皂苷F1的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1藥品與試劑 人參皂苷F1（ginsenoside F1），批號111763－201209，購自中國食品藥品檢定研究院；利福平（rifampicin，RIF），批號：B74218，購自美國Merck公司；胎牛血清（批號：NXA0544）、MEM培養(yǎng)基（批號：NWE0403）、非必需氨基酸（NEAA，批號：AWG16123）、EDTA胰酶（批號：SLBC7668）均購自美國Hyclone公司；Guisssia熒光檢測試劑盒（批號：0451201）購自美國NEB公司；TRIzol購自美國Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒及qPCR試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；P450-GloTMCYP3A4 Assay with Luciferin-IPA（批號：0000009296）購自美國Promega公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．1．2 主要儀器 MCO-20AIC型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；超凈工作臺（北京長城空氣凈化設(shè)備公司）；J-301型超高速離心機(jī)（Avanti公司）；VictorX5型酶標(biāo)儀（美國PerkinElmer公司）；SteponeTM272006169型Real-Time PCR儀（美國Ap-plied Biosystem公司）；DU-600型紫外分光光度計(jì)（Beckman公司）。

1．2方法

1．2．1細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) LS174T（人結(jié)腸癌細(xì)胞）購自北京協(xié)和細(xì)胞庫，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存，初次復(fù)蘇的細(xì)胞代數(shù)為第13代；PXR-CYP3A4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2工程細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。二者均用含10%滅活胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2孵箱，按常規(guī)方法培養(yǎng)，并取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1．2．2熒光素酶報告基因檢測 取本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的工程細(xì)胞株，并參照前期實(shí)驗(yàn)工作方法［11］，以細(xì)胞數(shù)1×105／孔接種于96孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)80%后去掉培養(yǎng)液，換無血清MEM培養(yǎng)基，按不同濃度分別加入20、50、100、200 μmol·L－1的人參皂苷F1，同時設(shè)置10 μmol·L－1的利福平（RIF）為陽性對照組，每組藥物設(shè)置6個復(fù)孔。分別在給藥24、48 h后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，進(jìn)行熒光檢測。熒光素酶活性的檢測用NEB BioLux Gaussia Lucifer-ase Assay Kit檢測試劑盒，在BioLuxGluc Assay Buff-er 1mL中加BioLuxGluc Substrate 10 μL，混勻后，吸取20 μL細(xì)胞培養(yǎng)基上清至檢測板孔中，然后每孔加入50 μL熒光檢測試劑并混勻。然后用酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，并記錄檢測結(jié)果。藥物對PXR的激活效應(yīng)用誘導(dǎo)倍數(shù)（fold induction）來反映，即每組的誘導(dǎo)倍數(shù)＝藥物處理組的熒光素酶活性值／溶劑對照組的熒光素酶活性值，并以此預(yù)測其對CYP3A4的誘導(dǎo)效應(yīng)。

1．2．3MTS檢測LS174T細(xì)胞活性 取對數(shù)生長期的LS174T細(xì)胞，制備成5×107·L－1的細(xì)胞懸液，按每孔100 μL接種于96孔板，放入37℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)；24、48 h后更換無血清培養(yǎng)基，并加入不同濃度人參皂苷F1（10、20、50、100、200、300、400、500 μmol·L－1），同時設(shè)置對照組和空白組，每組6個復(fù)孔；分別在24、48 h后，每孔加入MTS試劑10 μL，繼續(xù)孵育3～4 h；用酶標(biāo)儀測定每孔450 nm處的吸光度值（OD值），按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（IC）／%＝（實(shí)驗(yàn)組OD值－空白組OD值）／（對照組OD值－空白組OD值）×100%。

1．2．4Q-PCR檢測CYP3A4 mRNA水平變化 不同濃度人參皂苷F1（20、50、100、200 μmol·L－1）分別處理LS174T細(xì)胞24、48 h后，棄去培養(yǎng)基，用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA；紫外分光光度計(jì)檢測總RNA濃度和純度（ODA260／A280比值在1.8～2.0之間可用）。RT-PCR試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行熒光實(shí)時定量PCR檢測（本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次），具體操作參照說明書進(jìn)行。用于擴(kuò)增的特異性引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences used for Q-PCR reactions

1．2．5酶活性試劑盒檢測CYP3A4的酶活性變化參照Yang等［12］的方法，取LS174T細(xì)胞，制備成5×107·L－1的細(xì)胞懸液，按每孔100 μL接種于96孔板，放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)；24 h后更換無血清培養(yǎng)基，并加入不同濃度人參皂苷F1（20、50、100、200 μmol·L－1），同時設(shè)置空白對照組，每組6個復(fù)孔；分別在處理24、48 h后，每孔加入稀釋好的5 μmol·L－1的底物L(fēng)uciferin-IPA 50 μL，37℃環(huán)境下孵育30～60 min，再每孔加入等體積的Luciferin Detection Reagent，混勻；取50 μL混合液至不透光的白板，繼續(xù)孵育15～20 min，然后用酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，并記錄檢測結(jié)果。其誘導(dǎo)效應(yīng)由藥物處理組細(xì)胞活性值與空白對照組活性值的比值來反映。

1．2．6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，采用SAS 9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果用±s表示，兩組之間比較用t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2．1細(xì)胞熒光素酶報告基因檢測 熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，人參皂苷F1能夠明顯增強(qiáng)PXR的轉(zhuǎn)錄活性。如Fig 1所示，隨著人參皂苷F1濃度的增加（20、50、100、200 μmol·L－1），PXR的轉(zhuǎn)錄活性逐漸增強(qiáng)（P＜0.01），并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性；陽性對照藥利福平（RIF）組亦明顯增強(qiáng)了PXR的轉(zhuǎn)錄活性（P＜0.01）。

2．2人參皂苷F1對LS174T細(xì)胞活性的影響MTS結(jié)果顯示，隨著人參皂苷F1濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸下降。如Fig 2所示，低濃度的人參皂苷F1對細(xì)胞的存活率沒有影響（如10、20 μmol· L－1）；當(dāng)人參皂苷F1濃度高于300 μmol·L－1時，對LS174T的細(xì)胞活性抑制率可達(dá)40%。因此，本實(shí)驗(yàn)選取200 μmol·L－1以下的濃度作為人參皂苷

F1的實(shí)驗(yàn)濃度。

Fig 1 Effect of ginsenoside F1 on transactivation of PXR（±s，n＝6）

Fig 2 Effect of ginsenoside F1 on cell viability of LS174T（±s，n＝6）

2．3人參皂苷F1對LS174T細(xì)胞CYP3A4 mR-NA表達(dá)的影響 熒光實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度人參皂苷F1（20、50、100、200 μmol·L－1）分別處理LS174T 24、48 h后，能明顯誘導(dǎo)CYP3A4 mRNA的表達(dá)，如Fig 3所示，當(dāng)人參皂苷濃度為200 μmol·L－1時，誘導(dǎo)作用最為明顯（P ＜0.01）。其中，陽性對照藥利福平（RIF）組對CYP3A4 mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)作用可達(dá)5倍以上（P＜0.01）。

2．4人參皂苷F1對CYP3A4酶活性的影響 在對CYP3A4 mRNA水平檢測的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對CYP3A4酶活性進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示人參皂苷F1可以濃度依賴性地增強(qiáng)CYP3A4的酶活性。如Fig 4所示，陽性對照藥利福平（RIF）組，可明顯增強(qiáng)CYP3A4的酶活性達(dá)3.43倍（P＜0.05）；低濃度的人參皂苷F1（20 μmol·L－1）對CYP3A4的酶活性沒有明顯影響，50、100、200 μmol·L－1的人參皂苷F1可明顯增強(qiáng)CYP3A4的酶活性，并呈現(xiàn)濃度依賴性。

Fig 3 Effect of ginsenoside F1 on expression of CYP3A4 mRNA in LS174T cells（±s，n＝3）

Fig 4 Effect of ginsenoside F1 on enzyme activity of CYP3A4 in LS174T cells（±s，n＝6）

3　討論

本實(shí)驗(yàn)室前期研究工作建立了基于分泌型Gaussia熒光素酶報告基因pGLuc-Basic系統(tǒng)，將報告基因載體和人PXR表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，通過G418抗性篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，該細(xì)胞株具有使用分泌型熒光素酶載體、檢測方便、具備高通量潛力的優(yōu)勢，并采用雙遠(yuǎn)端增強(qiáng)子模式，實(shí)現(xiàn)可能的高誘導(dǎo)、高靈敏度，提高了篩選的效率［13］。

本研究基于以上篩選技術(shù)，發(fā)現(xiàn)人參皂苷F1能夠明顯激活孕烷X受體（PXR）的轉(zhuǎn)錄活性，并呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。為進(jìn)一步確證人參皂苷F1對CYP3A4的影響，本實(shí)驗(yàn)又選取了PXR表達(dá)較高的LS174T細(xì)胞，從CYP3A4的基因表達(dá)和酶活性兩個

方面進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，人參皂苷F1通過激活PXR以后，對CYP3A4的活性及表達(dá)有明顯的增強(qiáng)作用。前期本實(shí)驗(yàn)室的篩選結(jié)果顯示10 μmol· L－1的人參皂苷F1對PXR沒有轉(zhuǎn)錄激活作用［13］，與本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不一致，這可能與兩次實(shí)驗(yàn)所采用的人參皂苷F1濃度不一致有關(guān)，因此進(jìn)一步說明在特定濃度下高通量篩選又是可能會漏掉有陽性作用的篩選對象，改變篩選濃度可能會發(fā)現(xiàn)新的有陽性作用的化合物。PXR是CYP3A4的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，藥物通過激活PXR介導(dǎo)的信號通路調(diào)節(jié)CYP3A4的表達(dá)是影響藥物在體內(nèi)代謝的重要途徑［8－9］。某種藥物通過誘導(dǎo)或抑制P450酶特定的亞型或許就會改變另一種藥物的代謝清除特性，從而導(dǎo)致不利于機(jī)體的藥物相互作用。CYP3A4的底物范圍非常廣泛，包括膽汁酸、內(nèi)源性甾體激素以及50%的臨床常用藥物［14］。人參作為目前臨床上常用的一味中藥，其相關(guān)制品引起的臨床上藥物相互作用已有報道［15］，如丹參注射液與華法林合用時，丹參會增加華法林的血藥濃度而導(dǎo)致出血［16］。本實(shí)驗(yàn)中人參皂苷F1對PXR-CYP3A4通路的激活效應(yīng)，提示當(dāng)其與CYP3A4底物類藥物聯(lián)合使用時，可能會影響其代謝而導(dǎo)致不良的藥物相互作用，臨床聯(lián)合用藥時應(yīng)引起重視。

中草藥中含有的諸多天然活性成分，具有廣泛的生理功能，在臨床上的應(yīng)用日益普遍，尤其以中西藥聯(lián)合給藥的方式。也有越來越多的研究報道有些中藥或其有效成分會作用于藥物代謝酶而產(chǎn)生藥物相互作用，影響到其他藥物的代謝，甚至產(chǎn)生毒理效應(yīng)，如五味子和甘草處理大鼠后，會激活PXR并誘導(dǎo)大鼠肝微粒體中CYP3A4的表達(dá)，加速華法林和丙咪嗪等藥物的代謝清除［17］。因此，有必要加強(qiáng)中草藥及其有效成分對PXR-CYP3A4通路的影響及其作用機(jī)制的研究，對中藥更廣泛的臨床應(yīng)用及中西藥的聯(lián)合使用都具有重大意義。

（致謝：本實(shí)驗(yàn)在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所二所二室完成，衷心感謝指導(dǎo)老師高月研究員、王宇光副研究員提供的實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)器材及資金支持。）

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Ginsenoside F1 induces CYP3A4 expression through activation of human pregnane X receptor

YOU Wen-ting1，ZHOU Tao2，MA Zeng-chun2，LIANG Qian-de2，TANG Xiang-lin2，XIAO Cheng-rong2，TAN Hong-ling2，XIAO Yong2，WANG Yu-guang2，GAO Yue2
（1．Graduate School，Anhui Medical University，Hefei 230032，China；2．Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

Abstract：Aim To study the effect of ginsenoside F1 on the enzyme activity and expression of gene of CYP3A4 through activation of pregnane X receptor （PXR）．Methods With different concentrations of ginsenoside F1 treated on LS174T cells，the expression of CYP3A4 mRNA was determined by Q-PCR，and the enzyme activity was measured by P450-GloTMCYP3A4 assay according to the manufacturer′s instructions，fur-ther PXR-CYP3A4 stable translation HepG2 cell lines were used to test ginsenoside F1 activates PXR by re-porter gene screening assay．Results The results re- vealed that the levels of CYP3A4 gene and protein ex-pression were significantly increased by ginsenoside F1 in a concentration-dependent manner．At the same time，reporter gene screening showed that ginsenoside F1 could also enhance the transcriptional activity of PXR．Conclusion Ginsenoside F1 can significantly up-regulate the gene expression and enzyme activity of CYP3A4 via the PXR-CYP3A4 pathway．

Key words：ginsenoside F1；PXR；CYP3A4；quanti-tative PCR；mRNA；enzyme activity

作者簡介：油文亭（1989－），女，碩士生，研究方向：中藥藥理學(xué)，Tel：010-66930267，E-mail：youwenting1123＠126．com；高 月（1963－），女，博士，研究員，研究方向：中藥藥理學(xué)，通訊作者，Tel：010-66931312，E-mail：gaoyue＠bmi．a(chǎn)c．cn；王宇光（1979－），男，博士，副研究員，研究方向：分子藥理學(xué)，通訊作者，Tel：010-66932201，E-mail：wangyg＠bmi．a(chǎn)c．cn

基金項(xiàng)目：國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（No 2009 ZX09501-304）；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）資助項(xiàng)目（No 2011CB505304，2012CB518402）

收稿日期：2015－06－20，修回日期：2015－07－26

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）11－1536－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．012