鉤吻總堿對肝癌細胞氯通道的激活作用

王海波，孫曉雪，鄧志欽，呂瑞玲，賴周毅，孟 龍，朱林燕，陳麗新，王立偉

（暨南大學醫學院1．藥理學系、2．生理學系，廣東廣州 510632）

鉤吻總堿對肝癌細胞氯通道的激活作用

王海波1，孫曉雪2，鄧志欽1，呂瑞玲2，賴周毅2，孟 龍2，朱林燕1，陳麗新1，王立偉2

（暨南大學醫學院1．藥理學系、2．生理學系，廣東廣州 510632）

中國圖書分類號：R284．1；R329．25；R735．702．2

摘要：目的 探討鉤吻總堿對肝癌（HepG2）細胞氯通道的激活作用及對細胞容積的影響。方法 活細胞圖像法觀察記錄鉤吻總堿作用后HepG2細胞容積的變化；全細胞膜片鉗技術記錄鉤吻總堿對HepG2細胞膜電流的作用，通過細胞外灌流高滲液，氯通道阻斷劑tamoxifen和5-硝基-2-（3-苯丙胺）苯甲酸（NPPB）研究電流的生理學及藥理學特性。結果 細胞外灌流鉤吻總堿50 min，細胞體積減小（12.48± 2.2）%（P＜0.01），該現象可被氯通道阻斷劑tamoxifen抑制。膜片鉗結果顯示，細胞外灌流鉤吻總堿（2 μmol·L－1）可激活HepG2細胞膜氯電流，該電流有明顯外向優勢，無電壓及時間依賴性失活，其翻轉電位為（－3.21±0.67）mV，接近氯離子平衡電位（－0.9 mV），可被氯通道阻斷劑tamox-ifen和NPPB抑制，細胞外灌流47%高滲溶液亦可明顯抑制該電流。結論 鉤吻總堿可引起肝癌HepG2細胞體積縮小，誘導凋亡性容積縮小（AVD）發生，該作用可被氯通道阻斷劑明顯抑制，提示氯通道可能為鉤吻總堿抗癌作用的靶點之一。

關鍵詞：鉤吻總堿；肝癌細胞；凋亡性容積縮小；膜片鉗技術；氯通道；氯通道阻斷劑

網絡出版時間：2015－10－16 9：52 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．022．html

鉤吻（gelsemium），又名大茶藥、斷腸草等，是馬錢科植物葫蔓藤的根、葉及全草，全株有劇毒。長期以來，鉤吻用于治療濕疹、皮鞽、創傷性損傷、骨折、炎癥、潰瘍、慢性疼痛、焦慮等疾病［1］。近年來，人們開始關注鉤吻的抗腫瘤作用。研究顯示，鉤吻總堿（gelsemium alkaloids）可抑制肝癌HepG2細胞、卵巢癌細胞、乳腺癌細胞等細胞增殖，時間依賴性和濃度依賴性誘導細胞凋亡［2－4］。

氯通道是人體各種細胞廣泛分布的陰離子通道，參與細胞包括增殖、遷移等多種生理功能的調節，具有廣泛而重要的生理意義。我們實驗室的前期研究發現，氯通道參與多種抗腫瘤藥物誘導細胞凋亡的過程，激活容積敏感性氯通道產生凋亡性容積縮小（apoptotic volume decrease，AVD）以啟動細胞凋亡［5－7］。同時，研究發現，多種生物堿如長春新堿、小檗堿等均具有高效低毒的抗腫瘤作用［8－9］。鉤吻總堿是提取于馬錢科植物的一類吲哚生物堿，文獻報道，其可濃度依賴性和時間依賴性誘導肝癌HepG2細胞凋亡，從而發揮抗腫瘤作用。然而，系統性的文獻回顧，并未發現對鉤吻總堿抗腫瘤作用離子機制的研究。本實驗擬使用膜片鉗技術研究鉤吻總堿能否激活氯通道，進而探討鉤吻總堿的抗腫瘤作用是否與氯通道有關。

1　材料與方法

1．1細胞培養 人肝癌細胞（HepG2）培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基，培養基加入雙抗（10萬IU·L－1青霉素、0．1 g·L－1鏈霉素），常規培養于37℃，飽和濕度，含體積分數為0.05的CO2細胞培養箱中，隔天傳代1次。實驗時使用0．25%胰酶常規消化并重懸細胞，將細胞懸液收集于4 mL EP管中，每次取200 μL接種于直徑為22 mm的圓形玻片，于室溫下靜置30 min，待細胞貼壁后進行實驗。

1．2藥物與試劑 鉤吻總堿由暨南大學藥學院提供，溶解于二甲基亞砜（dimethyl sulpoxide，DMSO）配制成濃度為10 mmol·L－1的儲存液，實驗時用等滲灌流液稀釋成終濃度為2 μmol·L－1的工作液。Tamoxifen購于Sigma公司，溶解于DMSO中，配制成濃度為20 mmol·L－1的儲存液，實驗時用相應的細胞外灌流液稀釋成終濃度為20 μmol·L－1的工作液；NPPB購于Sigma公司，使用甲醇配制成100 mmol·L－1儲存液，實驗時稀釋至100 μmol·L－1工作液。

1．3細胞容積測量 將附有貼壁細胞的玻片放入特制灌流浴槽中，于倒置顯微鏡下尋找合適的視野，設置拍攝程序，通過Image Pro Plus軟件控制數字式攝像機動態拍攝，拍攝的圖片使用ScIon Image圖像分析軟件進行處理。通過測量細胞面積，進行面積與體積的轉換，轉換公式為：V＝4／3×π×（S／π）3／2。實驗分為3組：對照組灌流1 h等滲液；加藥組在灌流5 min等滲液后，在等滲液中加入2 μmol ·L－1鉤吻總堿，繼續記錄55 min；阻斷劑組在灌流5 min等滲液后，在等滲液中加入20 μmol·L－1tamoxifen預處理5 min后，再加入鉤吻總堿與tamoxifen混合液繼續記錄50 min。對細胞體積進行標準化處理：Vst＝（Vb÷Vi）×100%；Vb為鉤吻總堿處理后的細胞體積，Vi為等滲情況下的細胞體積。運用公式計算出細胞容積縮小率：ΔV%＝［（Vi－Vmin）÷Vi］×100%，Vmin為鉤吻總堿處理后細胞的最小體積。

1．4膜片鉗實驗

1．4．1細胞外灌流液 等滲灌流液（isotonic solu-tion）滲透壓為300 mOsmol·L－1，含（mmol·L－1）：70 NaCl，2 CaCl2，0．5 MgCl2，10 HEPES，140 D-man-nitol；高滲液（47%hyper）滲透壓為440 mOsmol· L－1，配方為等滲液中加入140 mmol·L－1的D-man-nitol。使用Osmomat 030冰點滲透壓計（Osmomat 030；Gonotec，Germany）測定配制溶液的滲透壓，用Tris堿調pH值至7.4。

1．4．2電極內液 電極內液含（mmol·L－1）：70 N-methyl-D-glucamine chloride（NMDG-Cl），1 EGTA，1．2 MgCl2，10 HEPES，140 D-mannitol，2 ATP，用Tris堿調pH值為7.20。

1．4．3全細胞膜片鉗記錄 取指數生長期的HepG2細胞，用0．25%胰酶消化重懸，將細胞懸液收集于4 mL EP管中，使用移液器每次取200 μL接種于直徑為22 mm的圓形玻片上，室溫下靜置30 min，待細胞貼壁后，將玻片黏附于特制浴槽并置于倒置顯微鏡進行實驗。膜片鉗參數設置及記錄方法見參考文獻［10］。

將貼有細胞的圓形玻片置于特制灌流系統中，采用全細胞記錄模式記錄HepG2細胞膜電流。在灌流等滲液時，記錄下2～4 min的穩定背景電流，隨后加入2 μmol·L－1鉤吻總堿灌流細胞，保持灌流液面的平穩，觀察并記錄激活電流的潛伏期、電流密度等參量。待激活電流達峰并平穩后，分別加入47%高滲液、tamoxifen、NPPB，觀察高滲液和氯通道阻斷劑對鉤吻總堿激活電流的影響，分別計算電流抑制率。抑制率計算公式：抑制率／%＝［（Cmax－CIso）－（CBlockers－CIso）］／（Cmax－CIso）×100%，其中CIso為灌流等滲液時基礎電流，Cmax為加入總堿后激活的最大電流，CBlockers為加入阻斷劑后的最大電流。

1．5統計學處理 實驗所得數據采用SPSS 13．0軟件進行統計學分析，數據用±s表示，根據實驗情況的不同，選擇配對t檢驗或獨立樣本t檢驗進行顯著性檢驗，每項實驗至少重復3次。

2　結果

2．1鉤吻總堿誘導HepG2細胞產生AVD 將貼壁的細胞玻片置于特制的灌流浴槽中持續細胞外灌流2 μmol·L－1鉤吻總堿溶液，在倒置相差顯微鏡下選擇合適的視野，通過拍圖軟件連續拍攝細胞圖像，觀察鉤吻總堿對細胞容積的影響。如Fig 1A、C所示，細胞外灌流等滲液時HepG2細胞體積比較穩定，在觀察的60 min內細胞體積無明顯變化（n＝15，P＞0.05）。當細胞外灌流2 μmol·L－1鉤吻總堿溶液時，可見細胞容積明顯縮小，出現AVD現象（Fig 1B、D）。在細胞外灌流鉤吻總堿溶液50 min后，細胞容積減小（12.48±2.2）%（n＝15，P＜0.01）。

2．2鉤吻總堿誘導HepG2細胞產生的AVD可被氯通道阻斷劑tamoxifen明顯抑制 為了探討AVD的出現是否與氯離子通道有關，本實驗在細胞外預先灌流氯通道阻斷劑tamoxifen后，繼而灌流同等濃度的tamoxifen和鉤吻總堿混合液。如Fig 2所示，

細胞外灌流tamoxifen 5 min后，細胞體積增大3.28%（n＝15，P＞0.05），繼而灌流tamoxifen與鉤吻總堿混合液后，細胞體積相比于tamoxifen灌流后的最大體積減小5.06%（n＝15，P＞0.05），相比于等滲液僅減小0.79%（n＝15，P＞0.05）。與單純灌流鉤吻總堿（細胞體積減小12.48%）相比，細胞體積縮小被明顯抑制（n＝15，P＜0.01），這提示鉤吻總堿引起HepG2細胞產生AVD可能與氯通道有關。

Fig 1 Changes of HepG2cell volume induced by gelsemium alkaloids（±s，n＝15）

Fig 2 Effects of tamoxifen on AVD induced by gelsemium alkaloids in HepG2cell（±s，n＝15）

2．3鉤吻總堿可以激活HepG2細胞電流 鉤吻總堿引起HepG2細胞產生AVD與氯通道有關，而AVD又是多種抗腫瘤藥物誘導癌細胞凋亡的特征性事件。為了進一步探討鉤吻總堿是否可以開放氯通道，通過細胞內水外流最終引起細胞體積縮小，我們采用全細胞膜片鉗技術記錄細胞外灌流鉤吻總堿后，HepG2細胞膜電流的變化。如Fig 3A所示，鉤吻總堿可以激活肝癌HepG2細胞電流。Fig 3B所示，當細胞外灌流等滲液時，細胞基礎電流較小，在＋80 mV電壓鉗制下，外向電流密度為（3.18±0.72）pA ·pF－1，在－80 mV電壓鉗制模式下，內向電流密度為（3.30±0.79）pA·pF－1。當在等滲液中加入2 μmol·L－1鉤吻總堿后，可以激活電流，其平均潛伏期為2.50 min（n＝15）。在＋80 mV電壓鉗制下，該激活電流外向電流密度為（33.20±2.85）pA· pF－1，內向電流密度為（21.94±3.03）pA·pF－1，呈

明顯的外向優勢（Fig 3B），無明顯的時間和電壓依賴性失活，該電流的翻轉電位為（－3.21±0.67）mV，接近本實驗條件下氯離子平衡電位理論值（－0.9 mV），這提示鉤吻總堿激活的電流為氯電流。

Fig 3 Currents induced by gelsemium alkaloids in HepG2cell（±s，n＝5）

2．4鉤吻總堿激活的電流可被氯通道阻斷劑tamoxifen和NPPB阻斷 tamoxifen和NPPB是常用的氯通道阻斷劑，為了證實鉤吻總堿激活的膜電流為氯電流，我們觀察了氯通道阻斷劑tamoxifen和NPPB對該激活電流的作用。如Fig 4A所示，細胞外灌流2 μmol·L－1鉤吻總堿可以激活一具有明顯外向優勢的電流，當細胞外灌流20 μmol·L－1tamoxifen后，可以完全抑制該電流。Fig 4B所示，在＋80 mV電壓鉗制下，tamoxifen可使外向電流由（32.82±2.48）pA·pF－1下降至（2.81±0.83）pA ·pF－1（n＝5，P＜0.01），抑制率為（111.07± 5.58）%；在－80 mV電壓鉗制下，內向電流由（22.13±4.71）pA·pF－1下降至（1.99±0.42）pA ·pF－1（n＝5，P＜0.01），抑制率為（106.09± 2.25）%，tamoxifen對內、外向電流的抑制率差異沒有統計學意義（n＝5，P＞0.05）。同樣，NPPB對鉤吻總堿激活的電流也有明顯抑制（Fig 4C、D）。100 μmol·L－1NPPB作用后，外向電流由（31.20± 2.85）pA·pF－1下降至（4.64±0.39）pA·pF－1（n ＝5，P＜0.01）抑制率為（95.24±5.97）%，內向電流由（21.94±3.30）pA·pF－1下降至（3.34±0.32）pA·pF－1（n＝5，P＜0.01），抑制率為（98.36± 5.60）%，NPPB對內、外向電流的抑制差異亦無統計學意義（n＝5，P＞0.05）（Fig 4C、D）。

2．5鉤吻總堿激活的氯電流具有容積敏感性 上述實驗證實了鉤吻總堿引起HepG2細胞產生AVD的同時，可以激活HepG2細胞氯電流，這兩種現象均可被氯通道阻斷劑tamoxifen明顯抑制。為了明確鉤吻總堿激活的氯電流與細胞容積變化的關系，我們觀察并記錄了47%高滲溶液對鉤吻總堿激活的氯電流的作用，以明晰氯通道在AVD中所起的作用。Fig 5A顯示鉤吻總堿激活的氯電流可被47%高滲溶液明顯抑制。如圖所示，細胞外灌流2 μmol ·L－1鉤吻總堿可以激活一有外向優勢的氯電流，當該電流達峰并穩定后，將鉤吻總堿換為47%高滲液后，可見外向電流由（29.94±3.59）pA·pF－1下降為（4.32±0.80）pA·pF－1，抑制率為（92.86± 7.69）%，內向電流由（24.10±1.85）pA·pF－1下降至（2.92±0.24）pA·pF－1，抑制率為（93.96± 5.78）%，內、外向電流抑制率差異無統計學意義（n ＝5，P＞0.05）。Fig 5B I／V曲線顯示在加入鉤吻總堿后，電流明顯激活，激活的電流達峰穩定后，加入47%高滲液可明顯抑制該電流（n＝5，P＜0.01）。

3　討論

鉤吻是馬錢科植物葫蔓藤的全草，其全株有劇毒，以根、葉為主，鉤吻總堿為其總生物堿提取物。在中國，鉤吻長期用于治療慢性疼痛、皮膚潰瘍等疾病。

近年來，鉤吻的抗腫瘤作用被廣泛研究，研究表明鉤吻可濃度依賴性和時間依賴性誘導多種腫瘤細胞凋亡。研究顯示，多種鉤吻堿單體如鉤吻素子、鉤吻堿甲及鉤吻素己可明顯抑制肝癌HepG2細胞增殖，其中鉤吻素己對HepG2細胞有明顯的時間和濃度依賴性抑制作用，而對正常的猴腎細胞無明顯細胞毒性［2］。該研究發現，用鉤吻堿處理48 h后的

HepG2細胞出現明顯形態學改變，細胞明顯皺縮并且漂浮，同時細胞周期被阻滯于S期，細胞凋亡率明顯增加，caspase-3、caspase-8和caspase-9活性呈濃度依賴性增加。而Zhang等［11］在研究鉤吻素子對人乳腺癌細胞（MCF-7）作用時發現，鉤吻素子可明顯誘導細胞凋亡，并阻滯細胞周期于G2／M期，同時發現，鉤吻素子處理后的MCF-7細胞Bcl-2的表達下調，而Bax和caspase-3的表達上調。

Fig 4 Inhibition of gelsemium alkaloids activated currents by tamoxifen and NPPB（±s，n＝5）

Fig 5 Inhibition of gelsemium alkaloids activated currents by 47%hypertonic solution（±s，n＝5）

我們實驗室前期工作表明，氯通道作為人體最為廣泛的陰離子，參與多種細胞生理活動調節，包括細胞凋亡［12］、細胞容積調節［13］、細胞遷移［14］等。研究顯示，抗腫瘤藥物可通過誘導細胞凋亡而發揮抗腫瘤作用。紫杉醇可誘導人低分化鼻咽癌細胞（CNE-2Z）凋亡［6］，順鉑可誘導人卵巢癌SKOV3／DDP細胞凋亡［15］，這些研究發現，當細胞外灌流抗腫瘤藥物時，細胞體積會緩慢減小，出現AVD，是細胞凋亡早期的特征性事件，離子流動在AVD中的作用已被普遍接受［16］。我們前期實驗發現，在PC12細胞外灌流H2O2溶液時會引起細胞容積縮小，而氯通道阻斷劑NPPB可以抑制H2O2引起的膜通透性增加和細胞皺縮，從而保護細胞免于凋亡［5］，可見Cl－和水外流是AVD的主要機制之一。

本實驗使用全細胞膜片鉗技術直接觀察鉤吻總堿對人肝癌細胞（HepG2）氯電流的作用。實驗結果表明，細胞外灌流含有鉤吻總堿的等滲溶液可以激活一具有明顯外向優勢的電流，該電流無明顯時間和電壓依賴性失活，翻轉電位為（－3.21±0.67）mV，接近于本實驗條件下Cl－理論上的平衡電位（－0.9 mV），該電流可被氯通道阻斷劑tamoxifen 和NPPB阻斷，故確定這一電流為氯電流。我們發現，tamoxifen對鉤吻總堿激活的內、外向氯電流抑制率均超過100%，這是因為tamoxifen不僅抑制了鉤吻總堿激活的氯電流，同時阻斷了基礎狀態下開放的氯通道，即阻斷了背景氯電流，故抑制率超過100%。另一方面，在tamoxifen抑制鉤吻總堿誘導的AVD實驗中，我們看到，加入tamoxifen預處理的HepG2細胞容積略微增加（n＝15，P＞0.05），這也說明tamoxifen可以阻斷基礎狀態下開放的氯通道，使水外流減少，從而引起細胞體積相對增加。在細胞AVD實驗中似乎提示鉤吻總堿激活的氯通道與細胞容積存在關系，為了驗證這一猜想，在鉤吻總堿激活的電流達峰并穩定后加入47%高滲溶液，我們發現，HepG2細胞明顯皺縮，與此同時，鉤吻總堿激活的氯電流幾乎被完全抑制。我們前期工作發現，當細胞外灌流低滲溶液時，由于滲透壓差，水分子跨細胞膜進入細胞引起細胞膨脹，細胞膨脹可激活容積敏感性氯通道，在電位差與濃度差的綜合作用下，氯離子外流帶走部分水，引起細胞體積縮小，即RVD（regulatory volume decrease）［17］。同理，當細胞外灌流高滲液后，由于細胞內外滲透壓差，細胞失水皺縮，容積縮小，關閉了容積敏感性氯通道，這說明鉤吻總堿激活的氯電流具有明顯的容積敏感性。

綜上所述，細胞外灌流鉤吻總堿溶液可引起細胞容積減小，產生AVD現象，而氯通道阻斷劑tamoxifen可以明顯抑制這一現象。鉤吻總堿激活的電流可被細胞外灌流47%高滲溶液抑制，顯示出與低滲激活容積敏感性氯電流相似的特征［17］，這說明該激活通道具有明顯的容積敏感性，通過開放氯通道引起氯離子和水的外流，最終導致細胞容積縮小。而細胞容積縮小是細胞凋亡早期的特征性事件，這提示了鉤吻總堿可能是通過誘導細胞凋亡性容積縮小過程而發揮抗腫瘤作用，而氯通道可能由于參與AVD的形成而作為鉤吻總堿抗腫瘤作用的靶點之一。然而，容積敏感性氯通道是鉤吻總堿抗腫瘤的直接靶點還是作為調節蛋白仍不清楚，有待進一步研究。

（致謝：本論文所涉及的所有實驗均在暨南大學醫學院501藥理學實驗室完成，在此對該實驗室提供的實驗幫助予以衷心的感謝。）

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Activation effects of gelsemium alkaloids on chloride channels in hepatic carcinoma cells

WANG Hai-bo1，SUN Xiao-xue2，DENG Zhi-qin1，LYU Rui-ling2，LAI Zhou-yi2，MENG Long2，ZHU Lin-yan1，CHEN Li-xin1，WANG Li-wei2
（1．Dept of Pharmacology，2．Dept of Physiology，Medical College，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of gelsemium alkaloids on chloride channels and cell volume in he-patic carcinoma cells．Methods The time-lapse live cell imaging and whole-cell patch clamp techniques were used respectively to detect the volume changes and currents induced by gelsemium alkaloids in HepG2cells．Results It was found that the cell volume was decreased by（12.48±2.2）%（P＜0.01）when ex-posed to gelsemium alkaloids for 50 min and this phe-nomenon could be inhibited by the chloride channel blocker tamoxifen．It was shown by whole-cell patch clamping that a chloride current could be evoked by extracellular application of gelsemium alkaloids（2 μmol·L－1）．The current was outward-rectified with-out obvious voltage-and time-dependent inactivation．The reversal potential of the current was（－3.21± 0.67）mV，which was close to the equilibrium poten-tial of chloride．The extracellular application of the chloride blockers，tamoxifen and 5-notro-2-（3-phenyl-propylamino）benzoic acid（NPPB），and 47%hyper-tonic solution inhibited the current significantly（P＜0.01）．Conclusion Gelsemium alkaloids could acti-vate chloride channels and induce a volume decrease （named apoptotic volume decrease，AVD），and these effect could be inhibited by chloride channel blockers．The results suggest that the chloride channel can be one of the targets of gelsemium alkaloids in their anti-cancer action．

Key words：gelsemium alkaloids；hepatic carcinoma cells；apoptotic volume decrease；patch clamp tech-niques；chloride channels；chloride channel blockers

作者簡介：王海波（1991－），男，碩士生，研究方向：離子通道藥理學，E-mail：931074539＠qq．com；陳麗新（1955－），女，博士，教授，博士生導師，研究方向：腫瘤藥理學、細胞生理與病理學，通訊作者，Tel：020-85228865，E-mail：chenlixinw＠sohu．com；王立偉（1959－），男，博士，教授，博士生導師，研究方向：細胞生理學，通訊作者，Tel：020-85226565，E-mail：wangli-weic＠sohu．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81273539，81173064）；教育部基金資助項目（No 20124401110009）；廣州市科技計劃基金資助項目（No 2013J450015）；東莞科技計劃基金資助項目（No 2011108102006）

收稿日期：2015－07－15，修回日期：2015－08－26

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）11－1529－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．011